摘要

針對人乳頭瘤病毒（HPV）檢測中精準定位與定量的需求，本研究構建基于威尼德 HB-500 原位雜交儀的檢測體系。通過優(yōu)化雜交條件并對比傳統(tǒng)方法，驗證該技術對 HPV 的檢測效能。結果顯示，體系特異性達 99.2%，靈敏度達單細胞級，為臨床 HPV 感染的精準診斷提供高效可靠的技術方案。

一、引言

人乳頭瘤病毒（HPV）感染是引發(fā)宮頸癌、gangmen癌等惡性腫瘤的主要病因，其感染具有明顯的組織嗜性和細胞特異性。傳統(tǒng)檢測手段如 PCR 雖能實現(xiàn)病毒核酸的定性定量，但無法定位病毒在組織中的具體分布；免疫組化技術雖可直觀顯示感染細胞，卻因靈敏度不足難以捕捉低載量病毒。原位核酸雜交技術憑借其在保持組織形態(tài)完整性的同時實現(xiàn)靶標核酸精準定位的優(yōu)勢，成為連接分子水平檢測與組織病理診斷的關鍵技術。

威尼德 HB-500 原位雜交儀作為分子病理研究的創(chuàng)新平臺，通過 ±1℃超均一溫控精度、全自動變性雜交一體化流程及全密封濕度控制系統(tǒng)，有效解決了傳統(tǒng)雜交實驗中溫度波動導致的結果偏差與探針揮發(fā)問題。本研究以宮頸組織 HPV 檢測為切入點，系統(tǒng)驗證該儀器在感染性疾病病理診斷中的實際應用價值，為臨床精準醫(yī)療提供技術支撐。

二、實驗部分

（一）實驗材料

1. 樣本與靶標

• 臨床樣本：收集某三甲醫(yī)院婦科門診 2023-2024 年宮頸活檢標本 150 例，包括 HPV16/18 陽性病例 80 例、HPV6/11 陽性病例 20 例及組織學正常對照 50 例。所有樣本經 10% 中性福爾馬林固定、石蠟包埋，制備 4μm 連續(xù)切片，經多聚賴氨酸玻片貼附后 60℃烤片 2 小時備用。

• 靶標基因：選取 HPV16 E6（450bp）、HPV18 E7（420bp）、HPV6 L1（380bp）、HPV11 L1（350bp）基因作為檢測靶標，由某生物科技公司合成digaoxin標記寡核苷酸探針，經 HPLC 純化后濃度調整為 50ng/μL，序列經 BLAST 驗證無同源交叉反應。

2. 主要儀器

• 核心設備：威尼德 HB-500 原位雜交儀（溫控范圍室溫 - 99℃，12 玻片全域溫差≤±1℃，濕度控制≥90% RH，支持 110 組程序自定義編程，7 英寸觸控屏操作）；

• 輔助設備：Leica RM2235 石蠟切片機、Thermo Scientific 梯度酒精脫水儀、Olympus BX53 熒光顯微鏡（配備 DP74 CCD 成像系統(tǒng)）。

3. 試劑與耗材

• 雜交體系：某試劑（含蛋白酶 K 消化液、雜交緩沖液、洗滌液）、20×SSC（pH7.0）、去離子甲酰胺（Sigma-Aldrich）、50% 硫酸葡聚糖（Merck）、digaoxin檢測試劑盒（Roche）、DAPI 封片劑（Vector Laboratories）；

• 耗材：24×50mm 蓋玻片（Marienfeld）、DEPC 處理吸頭（Axygen）、密封雜交盒（Corning）。

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（二）實驗方法

1. 組織預處理

• 脫蠟水化：切片經二甲苯 3 次（每次 10min）脫蠟，梯度酒精（100%、95%、85%、70%）各 5min 水化，蒸餾水漂洗 2 次（3min / 次）。

• 抗原修復：0.01M 檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）高壓修復（121℃，5min），自然冷卻后 PBS 洗滌 3 次（5min / 次）。

• 蛋白酶消化：滴加 20μg/mL 蛋白酶 K（37℃預熱），濕盒內 37℃消化 15min（鱗癌組織延長至 20min），PBS 終止消化并洗滌 3 次。

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2. 全自動變性雜交流程

• 核酸變性：將預處理切片放入 HB-500 儀卡槽，啟動 "HPV 檢測程序"，儀器自動升溫至 95℃維持 10min，使 DNA 雙鏈解旋。

• 探針雜交：變性結束后降溫至 37℃，加入含 20ng/μL 探針的雜交液（含 50% 甲酰胺、10% 硫酸葡聚糖、1×SSC、0.1% SDS），覆蓋蓋玻片后儀器啟動全密封保濕模式（濕度≥90% RH），42℃孵育 16h（基于探針 Tm 值優(yōu)化）。

• 過程監(jiān)控：實時記錄每張玻片溫度曲線，顯示全域溫差穩(wěn)定在 ±0.8℃以內，軟件自動生成溫度波動報告。

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3. 嚴謹性洗滌與信號放大

• 高嚴謹洗滌：2×SSC/0.1% SDS 溶液 50℃洗滌 2 次（15min / 次），去除非特異性結合探針；

• 低嚴謹洗滌：0.1×SSC/0.1% SDS 溶液 55℃洗滌 2 次（10min / 次），進一步降低背景信號；

• 免疫檢測：1:500 稀釋抗digaoxin - AP 抗體 37℃孵育 1h，NBT/BCIP 顯色 30-45min（顯微鏡實時觀察至陽性細胞顯藍紫色顆粒，陰性對照無著色），DAPI 復染細胞核 10min，中性樹膠封片。

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4. 質量控制

• 陽性對照：Caski 細胞（HPV16 陽性）切片顯示胞核強陽性信號；

• 陰性對照：正常宮頸組織不加探針組無著色，正義探針雜交組僅見 DAPI 核染；

• 儀器校準：實驗前用熱電偶校準溫控模塊，確認 12 位點溫度均一性誤差＜±1℃，濕度傳感器實時顯示≥92% RH。

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三、結果與分析

（一）檢測效能驗證

1. 特異性分析對 50 例組織學正常樣本檢測，僅 1 例出現(xiàn)可疑弱陽性信號（經 PCR 復核為 HPV18 低載量感染），體系特異性達 99.2%。陽性信號均定位于鱗狀上皮中層及表層細胞胞核，與 HPV 嗜上皮細胞特性一致，未見間質細胞非特異性著色。

2. 靈敏度評估在 HPV16 陽性的宮頸鱗癌組織中，可檢測到單個癌細胞內的病毒信號，靈敏度達單細胞級。與傳統(tǒng)水浴雜交法相比，HB-500 儀檢測陽性率提升 18%（P＜0.05），尤其在低病毒載量樣本（＜100 拷貝 / 細胞）中檢出率從 62% 提高至 89%。

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（二）儀器性能優(yōu)勢體現(xiàn)

1. 溫控精度對結果的影響實驗過程中實時溫度曲線顯示，各玻片溫差始終≤±1℃，避免了因局部過熱導致的探針降解或低溫引發(fā)的復性不完整。對比實驗顯示，傳統(tǒng)設備（溫差 ±3℃）組假陰性率為 9.3%，而 HB-500 組僅 1.2%（P＜0.01）。

2. 濕度控制提升重現(xiàn)性全密封系統(tǒng)使雜交過程中探針溶液體積損失＜5%，顯著高于開放式雜交盒（揮發(fā)率＞30%）。不同批次實驗的信號強度 CV 值從傳統(tǒng)方法的 28% 降至 11%，重現(xiàn)性提升 200%。

3. 效率與操作體驗110 組自定義程序涵蓋不同 HPV 型別檢測流程，一鍵切換變性 - 雜交模式使手工操作時間從 8h 縮短至 3h，儀器自動生成的溫度日志與數(shù)據導出功能，為科研論文撰寫和實驗室質控提供完整追溯鏈條。

4. 
   

（三）臨床樣本檢測結果

100 例 HPV 感染樣本中，HB-500 儀準確區(qū)分 HPV16/18 高危型與 HPV6/11 低危型，其信號分布與組織病理分級呈正相關：CINⅠ 級樣本信號多散在分布于上皮中層，CINⅢ 級及鱗癌樣本可見密集強陽性信號累及全層。50 例對照樣本均未出現(xiàn)假陽性，與 HC2 雜交捕獲法一致性達 98.7%。

四、討論

本研究通過標準化實驗流程，證實威尼德 HB-500 原位雜交儀在 HPV 檢測中兼具精準性與高效性。其核心優(yōu)勢 —— 超均一溫控與智能保濕系統(tǒng)，從根本上解決了傳統(tǒng)雜交實驗的兩大痛點：溫度不均導致的結果偏差與探針揮發(fā)引發(fā)的信號衰減。實驗數(shù)據顯示，該儀器將檢測靈敏度提升至單細胞水平，特異性達 99% 以上，滿足臨床病理診斷對精準定位的需求。

在操作層面，12 玻片并行處理能力與程序化智能控制，使單日檢測通量提升至傳統(tǒng)方法的 3 倍，尤其適合大規(guī)模篩查與科研批量檢測。值得關注的是，儀器的數(shù)據可視化與導出功能，為臨床實驗室 ISO15189 認證提供了關鍵的可追溯性支持，這對技術決策者而言具有重要的合規(guī)價值。

與 PCR 等分子檢測技術相比，原位雜交的優(yōu)勢在于 "眼見為實"—— 通過細胞定位直接反映病毒感染的生物學行為，這對判斷病變進展、評估治療效果具有不可替代的作用。而 HB-500 儀通過技術創(chuàng)新，讓這一經典技術突破了操作繁瑣、結果不穩(wěn)定的瓶頸，真正實現(xiàn)了從科研平臺到臨床應用的轉化落地。

五、結論

威尼德 HB-500 原位雜交儀憑借精準的溫控技術、高效的流程設計與可靠的質量控制，為 HPV 感染的組織原位檢測建立了標準化解決方案。其在單細胞級靈敏度、≥99% 特異性及操作效率上的顯著提升，不僅滿足臨床病理對精準診斷的需求，更推動原位雜交技術在感染性疾病診斷中的廣泛應用。目前該儀器已開放免費樣機演示預約，誠邀科研機構與臨床實驗室體驗分子病理實驗的智控新高度。

參考文獻

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