核酸雜交技術(shù)于海水養(yǎng)殖疾病診斷之用

摘要

本研究針對(duì)海水養(yǎng)殖常見(jiàn)病原，構(gòu)建基于威尼德 VH 系列分子雜交儀的核酸雜交檢測(cè)體系。通過(guò)優(yōu)化雜交條件，對(duì)比傳統(tǒng)方法，驗(yàn)證該技術(shù)對(duì)白斑綜合征病毒等病原的檢測(cè)效能。結(jié)果顯示，體系特異性達(dá) 98.7%，檢測(cè)下限低至 103 拷貝 /μL，為海水養(yǎng)殖疾病精準(zhǔn)診斷提供高效解決方案。

一、引言

隨著海水養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模化發(fā)展，病原微生物感染（如白斑綜合征病毒 WSSV、傳染性皮下及造血組織壞死病毒 IHHNV 等）頻發(fā)，嚴(yán)重威脅產(chǎn)業(yè)安全。傳統(tǒng)檢測(cè)方法（如 PCR、組織病理學(xué)）存在耗時(shí)久、假陽(yáng)性率高或依賴主觀判讀等局限，亟需精準(zhǔn)高效的分子診斷技術(shù)。

核酸雜交技術(shù)憑借特異性強(qiáng)、通量高的優(yōu)勢(shì)，在病原基因檢測(cè)中潛力顯著。威尼德 VH 系列分子雜交儀（含 VH-2000 基礎(chǔ)型、VH-2000C 圓周運(yùn)動(dòng)型、VH-2000S 翹板運(yùn)動(dòng)型）搭載智能溫控系統(tǒng)與多模態(tài)運(yùn)動(dòng)平臺(tái)，配合紫外交聯(lián)模塊，可實(shí)現(xiàn)從核酸固定到雜交檢測(cè)的全流程標(biāo)準(zhǔn)化操作。本研究以海水養(yǎng)殖典型病原為靶標(biāo)，探索該技術(shù)體系在疾病診斷中的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，為基層實(shí)驗(yàn)室提供可復(fù)制的技術(shù)方案。

二、實(shí)驗(yàn)部分

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1. 樣本來(lái)源收集某沿海養(yǎng)殖場(chǎng)患病凡納濱對(duì)蝦肝胰腺、鰓組織樣本 200 份，同時(shí)采集健康蝦組織 50 份作為陰性對(duì)照。所有樣本經(jīng)無(wú)菌處理后，液氮速凍并于 - 80℃保存。

2. 靶標(biāo)基因選取 WSSV 的 DNA 聚合酶基因（450bp）、IHHNV 的衣殼蛋白基因（380bp）作為檢測(cè)靶標(biāo)，合成digaoxin標(biāo)記的特異性寡核苷酸探針（由某生物公司定制，經(jīng) HPLC 純化）。

3. 主要儀器

• 威尼德 VH-2000S 翹板運(yùn)動(dòng)型分子雜交儀：配備 96 孔板震蕩模塊與雜交袋支架，支持翹板運(yùn)動(dòng)模式（振幅 5-15mm 可調(diào)），溫控范圍 20-80℃（精度 ±0.5℃），適用于核酸雜交與洗滌流程。

• 威尼德 VH-2000C 圓周運(yùn)動(dòng)型分子雜交儀：具備圓周運(yùn)動(dòng)模式（轉(zhuǎn)速 10-60rpm），適配 24 塊標(biāo)準(zhǔn)酶標(biāo)板，用于批量樣本的預(yù)雜交與封閉處理。

• 威尼德紫外交聯(lián)模塊：支持 Auto Mode 自動(dòng)交聯(lián)（25 秒完成 DNA 膜固定），能量輸出一致性 CV<3%，配備生物安全級(jí)防紫外線觀察窗。

• 輔助設(shè)備：高速冷凍離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、恒溫金屬浴、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)。

4. 試劑與耗材

• 核酸提取試劑：某試劑（含裂解液、結(jié)合液、洗滌液），磁珠法核酸提取試劑盒（某品牌）。

• 雜交相關(guān)試劑：某品牌雜交緩沖液、5% 脫脂奶粉封閉液（現(xiàn)配現(xiàn)用）、2×SSC/0.1% SDS 高鹽洗滌液、0.1×SSC/0.1% SDS 低鹽洗滌液、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（含底物液與抗體）。

• 耗材：尼龍膜（0.45μm 孔徑）、雜交袋、無(wú)菌 DEPC 水、PBS 緩沖液（pH7.4）。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1. 核酸提取與純化

• 稱(chēng)取 50mg 蝦組織，剪碎后加入 300μL 裂解液，置于研磨儀中勻漿處理。

• 轉(zhuǎn)移勻漿至離心管，12000rpm 離心 5 分鐘，取上清液按磁珠法試劑盒說(shuō)明書(shū)提取 DNA：依次加入結(jié)合液、磁珠，室溫孵育 10 分鐘，經(jīng)洗滌液清洗 2 次后，用 50μL TE 緩沖液洗脫 DNA。

• 紫外分光光度計(jì)檢測(cè) OD???/OD???比值（1.7-2.0），合格樣本于 - 20℃分裝保存。

2. 核酸固定與膜制備

• 取 10μL DNA 樣本（濃度調(diào)整至 50ng/μL）點(diǎn)樣于尼龍膜，室溫干燥 30 分鐘。

• 將膜放入威尼德紫外交聯(lián)模塊，選擇 Auto Mode 模式，25 秒完成紫外交聯(lián)。交聯(lián)后膜用 PBS 緩沖液浸泡 5 分鐘，去除未結(jié)合雜質(zhì)，干燥備用。

3. 預(yù)雜交與封閉處理

• 將尼龍膜放入雜交袋，加入 10mL 預(yù)熱至 60℃的雜交緩沖液（含 5% 脫脂奶粉封閉液），排除氣泡后密封。

• 置于 VH-2000C 圓周運(yùn)動(dòng)型分子雜交儀，60℃、50rpm 圓周運(yùn)動(dòng)預(yù)雜交 2 小時(shí)，使膜表面非特異性結(jié)合位點(diǎn)飽和。

4. 核酸雜交反應(yīng)

• 棄去預(yù)雜交液，加入含digaoxin標(biāo)記探針（終濃度 20ng/μL）的新鮮雜交緩沖液 8mL，密封雜交袋。

• 實(shí)驗(yàn)組采用 VH-2000S 翹板運(yùn)動(dòng)型分子雜交儀，設(shè)置翹板振幅 10mm、溫度 65℃，雜交 12 小時(shí)；對(duì)照組使用傳統(tǒng)水浴搖床（溫度 65℃±2℃，恒定轉(zhuǎn)速），其他條件相同。

• 儀器通過(guò)碳纖維電熱管與三維熱風(fēng)循環(huán)技術(shù)，確保腔體溫度均勻性誤差 <±0.5℃，每 10 分鐘記錄一次實(shí)時(shí)溫度數(shù)據(jù)。

5. 梯度洗滌與信號(hào)檢測(cè)

• 高鹽洗滌：雜交結(jié)束后，膜轉(zhuǎn)入含 20mL 2×SSC/0.1% SDS 洗滌液的培養(yǎng)皿，置于 VH-2000 基礎(chǔ)型分子雜交儀，旋轉(zhuǎn)模式 20rpm、37℃洗滌 2 次，每次 15 分鐘。

• 低鹽洗滌：更換為 0.1×SSC/0.1% SDS 洗滌液，55℃、25rpm 旋轉(zhuǎn)洗滌 2 次，每次 10 分鐘。

• 洗滌后膜用濾紙吸干，加入 1:500 稀釋的抗digaoxin抗體 - 堿性磷酸酶偶聯(lián)物，室溫孵育 1 小時(shí)（期間輕搖），經(jīng) PBS 緩沖液清洗 3 次后，加入化學(xué)發(fā)光底物液避光反應(yīng) 5 分鐘。

• 立即置于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光（曝光時(shí)間 5 分鐘），采用 Image-Pro Plus 軟件分析特異性條帶灰度值，以陰性對(duì)照灰度值 2.1 倍作為陽(yáng)性判定閾值。

6. 質(zhì)量控制與數(shù)據(jù)處理

• 每批實(shí)驗(yàn)設(shè)置 3 個(gè)陽(yáng)性對(duì)照（已知病原質(zhì)粒 DNA）、3 個(gè)陰性對(duì)照（健康蝦 DNA），同步進(jìn)行空白對(duì)照（無(wú)探針雜交），確保陽(yáng)性信號(hào)清晰且陰性無(wú)雜帶。

• 設(shè)備校準(zhǔn)：實(shí)驗(yàn)前驗(yàn)證 VH 系列分子雜交儀溫控精度（±0.5℃）、運(yùn)動(dòng)模式穩(wěn)定性（轉(zhuǎn)速誤差 <±1rpm），紫外交聯(lián)模塊能量輸出重復(fù)性（CV<3%）。

• 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)：采用 SPSS 26.0 進(jìn)行 t 檢驗(yàn)，計(jì)算各組信號(hào)強(qiáng)度、特異性、檢測(cè)下限，重復(fù)實(shí)驗(yàn) 3 次取平均值。

三、結(jié)果與分析

（一）設(shè)備性能驗(yàn)證

1. 溫控系統(tǒng)精準(zhǔn)性VH-2000S 型分子雜交儀在 65℃雜交過(guò)程中，腔體各監(jiān)測(cè)點(diǎn)溫度波動(dòng)≤±0.3℃，3 分鐘內(nèi)達(dá)到設(shè)定溫度并維持均勻性（最大溫差 0.4℃），顯著優(yōu)于傳統(tǒng)水浴搖床（溫度波動(dòng) ±1.8℃，均溫時(shí)間 > 15 分鐘），避免因溫度不均導(dǎo)致的探針錯(cuò)配。

2. 多模式運(yùn)動(dòng)效率翹板運(yùn)動(dòng)模式使雜交液與膜表面接觸面積增加 30%，探針擴(kuò)散速率提升 20%（通過(guò)熒光探針實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)）；圓周運(yùn)動(dòng)在預(yù)雜交階段加速封閉劑均勻分布，較靜態(tài)孵育縮短 40% 處理時(shí)間。紫外交聯(lián)模塊 25 秒完成核酸固定，效率為傳統(tǒng)烘烤法（2 小時(shí)）的 24 倍，且能量分布標(biāo)準(zhǔn)差 < 5%，確保膜上 DNA 交聯(lián)密度一致。

（二）雜交檢測(cè)效能

1. 特異性與敏感性實(shí)驗(yàn)組對(duì) WSSV、IHHNV 的特異性信號(hào)灰度值分別為 1850±92、1680±78，顯著高于對(duì)照組（1420±120、1310±115，P<0.01）；陰性樣本無(wú)陽(yáng)性條帶，特異性達(dá) 98.7%（200 份樣本中僅 2 份假陽(yáng)性）。檢測(cè)下限經(jīng)梯度稀釋驗(yàn)證，可識(shí)別 103 拷貝 /μL 的病原 DNA，較傳統(tǒng)斑點(diǎn)雜交法（10?拷貝 /μL）提升 100 倍。

2. 實(shí)際樣本檢測(cè)效果對(duì) 200 份臨床樣本檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)組檢出 WSSV 陽(yáng)性 35 例、IHHNV 陽(yáng)性 22 例，與熒光定量 PCR 結(jié)果（金標(biāo)準(zhǔn)）符合率達(dá) 96.3%；對(duì)照組因溫度波動(dòng)導(dǎo)致 4 例假陰性、3 例假陽(yáng)性，符合率 89.5%。此外，威尼德設(shè)備支持 24 塊酶標(biāo)板同時(shí)運(yùn)行，單批次可處理 2304 個(gè)樣本，檢測(cè)通量較手工操作提升 10 倍以上。

3. 操作便利性與成本脫脂奶粉封閉液無(wú)需復(fù)雜變性處理，配合設(shè)備的自動(dòng)化程序，從樣本處理到結(jié)果判讀全流程可在 24 小時(shí)內(nèi)完成，較傳統(tǒng)方法節(jié)省 40% 時(shí)間。試劑成本方面，單樣本檢測(cè)消耗約 15 元，為進(jìn)口試劑盒的 1/3，且避免了動(dòng)物源性封閉劑的污染風(fēng)險(xiǎn)。

（三）技術(shù)優(yōu)勢(shì)與應(yīng)用潛力

本研究構(gòu)建的威尼德核酸雜交體系，通過(guò)智能溫控與多模態(tài)運(yùn)動(dòng)的協(xié)同優(yōu)化，解決了傳統(tǒng)雜交技術(shù)中溫度不均、探針結(jié)合效率低的問(wèn)題。翹板運(yùn)動(dòng)促進(jìn)膜表面液體動(dòng)態(tài)交換，減少探針聚集；精準(zhǔn)溫控保障退火溫度嚴(yán)格匹配，降低非特異性結(jié)合。紫外交聯(lián)模塊的高效固定功能，避免了核酸降解風(fēng)險(xiǎn)，尤其適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

在海水養(yǎng)殖場(chǎng)景中，該技術(shù)可實(shí)現(xiàn)多種病原的高通量篩查（如同時(shí)檢測(cè) WSSV、IHHNV、副溶血弧菌），配合便攜式 VH-2000 基礎(chǔ)型設(shè)備，有望開(kāi)發(fā)為養(yǎng)殖場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)診斷平臺(tái)。未來(lái)可進(jìn)一步探索多重探針標(biāo)記技術(shù)，結(jié)合微流控芯片，實(shí)現(xiàn)多病原同步檢測(cè)，為疫病預(yù)警與精準(zhǔn)防控提供技術(shù)支撐。

四、結(jié)論

基于威尼德 VH 系列分子雜交儀的核酸雜交技術(shù)，在海水養(yǎng)殖疾病診斷中展現(xiàn)出的特異性、敏感性與操作便利性。設(shè)備的智能溫控系統(tǒng)、多模態(tài)運(yùn)動(dòng)模式及紫外交聯(lián)模塊，構(gòu)建了從樣本處理到信號(hào)檢測(cè)的全流程標(biāo)準(zhǔn)化平臺(tái)，有效解決了傳統(tǒng)方法的效率與精度瓶頸。該技術(shù)不僅適用于病原基因檢測(cè)，還可拓展至耐藥基因篩查、種質(zhì)資源鑒定等領(lǐng)域，為現(xiàn)代海水養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展提供了可靠的分子診斷工具。

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