摘要

核心蛋白聚糖在組織修復(fù)與疾病機(jī)制研究中具重要價(jià)值，但其原核表達(dá)面臨轉(zhuǎn)化效率低、蛋白活性受損等難題。本研究借助威尼德 Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀，構(gòu)建高效原核表達(dá)體系。通過(guò)雙波協(xié)同技術(shù)優(yōu)化大腸桿菌 BL21 (DE3) 轉(zhuǎn)化條件，使重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化率提升 40%，為規(guī)模化生產(chǎn)高活性核心蛋白聚糖提供技術(shù)支撐。

引言

核心蛋白聚糖（Decorin）作為細(xì)胞外基質(zhì)的重要組分，在調(diào)控膠原纖維形成、抑制腫瘤細(xì)胞增殖等生理過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其重組表達(dá)產(chǎn)物在創(chuàng)傷修復(fù)材料、抗腫瘤藥物研發(fā)等領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊應(yīng)用前景。然而，原核表達(dá)系統(tǒng)中存在的細(xì)胞膜屏障效應(yīng)、重組質(zhì)粒導(dǎo)入效率低以及誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程中蛋白包涵體形成等問(wèn)題，導(dǎo)致目標(biāo)蛋白產(chǎn)量低、活性維持困難，成為制約其產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)的瓶頸。

電穿孔技術(shù)作為原核細(xì)胞基因遞送的核心手段，通過(guò)脈沖電場(chǎng)瞬時(shí)改變細(xì)胞膜通透性，實(shí)現(xiàn)外源 DNA 的高效導(dǎo)入。威尼德 Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀突破傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染技術(shù)局限，創(chuàng)新性集成雙波協(xié)同技術(shù)與智能防護(hù)系統(tǒng)，針對(duì)原核細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)特性，可精準(zhǔn)匹配方波與指數(shù)波的合適組合，在保證細(xì)胞高存活率的同時(shí)顯著提升轉(zhuǎn)化效率。其內(nèi)置的 200 + 種細(xì)胞株數(shù)據(jù)庫(kù)包含大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等常用原核表達(dá)宿主，結(jié)合智能預(yù)優(yōu)化系統(tǒng)，可快速完成新菌株的參數(shù)預(yù)判，為構(gòu)建高效穩(wěn)定的核心蛋白聚糖原核表達(dá)體系提供了革命性解決方案。

材料與方法

1. 實(shí)驗(yàn)材料

宿主菌株：大腸桿菌 BL21 (DE3)（實(shí)驗(yàn)室保藏，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證遺傳背景清晰）目標(biāo)基因：人源核心蛋白聚糖編碼序列（通過(guò) RT-PCR 從正常成纖維細(xì)胞中克隆，經(jīng)某試劑公司測(cè)序確認(rèn)序列正確）表達(dá)載體：pET-28a (+) 質(zhì)粒（含卡那霉素抗性基因，實(shí)驗(yàn)室保存）試劑：LB 培養(yǎng)基（某試劑，按標(biāo)準(zhǔn)配方配制）、卡那霉素（某試劑，終濃度 50μg/mL）、IPTG（某試劑，誘導(dǎo)濃度 1mM）、電轉(zhuǎn)緩沖液（10% 甘油溶液，經(jīng) 0.22μm 濾膜除菌）、蛋白提取試劑盒（某品牌，包含裂解緩沖液、親和層析樹(shù)脂等）

2. 主要儀器

威尼德 Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀（配備 0.2cm 電轉(zhuǎn)杯，電極表面經(jīng)納米級(jí)導(dǎo)電涂層處理，適配原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化）高速冷凍離心機(jī)（某品牌，轉(zhuǎn)速范圍 100-15000rpm，溫控精度 ±0.5℃）恒溫?fù)u床（某品牌，轉(zhuǎn)速精度 ±1rpm，溫度控制范圍 20-60℃）熒光定量 PCR 儀（某品牌，用于重組質(zhì)粒拷貝數(shù)檢測(cè)）SDS-PAGE 電泳系統(tǒng)（某品牌，支持 10-20% 濃度梯度膠制備）紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（某品牌，用于蛋白濃度測(cè)定）

3. 原核表達(dá)體系構(gòu)建

3.1 重組質(zhì)粒制備

將核心蛋白聚糖編碼序列經(jīng) NcoI 和 XhoI 雙酶切后，與同樣酶切處理的 pET-28a (+) 載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞。挑取單菌落于含卡那霉素的 LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳與測(cè)序驗(yàn)證，獲得正確重組質(zhì)粒 pET-28a-Decorin。

3.2 感受態(tài)細(xì)胞制備

取 - 80℃凍存的大腸桿菌 BL21 (DE3) 接種于 5mL LB 培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)至 OD600=0.6。將菌液冰浴 30 分鐘，4℃、5000rpm 離心 10 分鐘收集菌體，用預(yù)冷的電轉(zhuǎn)緩沖液洗滌 3 次，最終重懸于 10% 甘油溶液中，調(diào)整細(xì)胞濃度至 1×101?CFU/mL，分裝成 50μL / 管，立即用于電轉(zhuǎn)化或液氮速凍后 - 80℃保存。

3.3 電穿孔轉(zhuǎn)化優(yōu)化

將 5μL 重組質(zhì)粒（濃度 1μg/μL）與 50μL 感受態(tài)細(xì)胞混勻，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的 0.2cm 電轉(zhuǎn)杯中。在威尼德 Gene Pulser X2 電穿孔儀上選擇 "原核細(xì)胞優(yōu)化" 模式，啟動(dòng)智能預(yù)優(yōu)化系統(tǒng)：

1. 雙波協(xié)同參數(shù)設(shè)置：針對(duì)大腸桿菌膜特性，自動(dòng)匹配方波脈沖（電壓根據(jù)細(xì)胞濃度動(dòng)態(tài)調(diào)整，初始預(yù)設(shè)值適配 1×101?CFU/mL）與指數(shù)波脈沖的組合，脈沖次數(shù) 3 次，脈沖間隔 1 秒。

2. 電弧防護(hù)系統(tǒng)：處理前自動(dòng)進(jìn)行電阻預(yù)檢，根據(jù)電轉(zhuǎn)緩沖液導(dǎo)電性實(shí)時(shí)校準(zhǔn)脈沖輸出，確保能量波動(dòng)范圍＜1%。

3. 智能交互操作：通過(guò) 10 英寸觸控屏實(shí)時(shí)監(jiān)控脈沖波形，確認(rèn)參數(shù)無(wú)誤后腳踏觸發(fā)脈沖，避免手動(dòng)操作誤差。

轉(zhuǎn)化后立即加入 950μL 無(wú)抗性 LB 培養(yǎng)基，37℃振蕩復(fù)蘇 1 小時(shí)，取 100μL 涂布于含卡那霉素的 LB 平板，37℃培養(yǎng) 12 小時(shí)后計(jì)數(shù)菌落，計(jì)算轉(zhuǎn)化率（轉(zhuǎn)化子數(shù) /μg 質(zhì)粒 DNA）。

3.4 誘導(dǎo)表達(dá)與蛋白純化

挑取陽(yáng)性克隆接種于 5mL 含卡那霉素的 LB 培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)至 OD600=0.8，按 1:100 比例轉(zhuǎn)接至 500mL 發(fā)酵培養(yǎng)基。當(dāng) OD600 達(dá) 1.0 時(shí)，加入 IPTG 誘導(dǎo) 4 小時(shí)，4℃、8000rpm 離心收集菌體。采用超聲破碎法裂解細(xì)胞，離心后分別收集上清（可溶性蛋白）與沉淀（包涵體）。上清液經(jīng) Ni-NTA 親和層析純化，梯度洗脫獲得目的蛋白，SDS-PAGE 電泳分析純度，Bradford 法測(cè)定蛋白濃度。

3.5 對(duì)比實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)置兩組對(duì)照實(shí)驗(yàn)：A 組采用傳統(tǒng)方波電穿孔儀（某品牌）進(jìn)行轉(zhuǎn)化，固定參數(shù)為電壓 2.5kV/cm、脈沖時(shí)長(zhǎng) 5ms、單次脈沖；B 組使用化學(xué)轉(zhuǎn)化法（CaCl?法），其余培養(yǎng)條件與實(shí)驗(yàn)組一致。比較不同轉(zhuǎn)化方法對(duì)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化率、目的蛋白表達(dá)量及活性的影響。

4. 結(jié)果與討論

4.1 電穿孔轉(zhuǎn)化效率分析

威尼德 Gene Pulser X2 處理的實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)化率達(dá) 8.2×10?CFU/μg，較 A 組的 5.8×10?CFU/μg 提升 41%，顯著高于 B 組的 1.5×10?CFU/μg（圖 1）。通過(guò)熒光定量 PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)化后細(xì)胞內(nèi)重組質(zhì)粒拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組單菌體質(zhì)粒拷貝數(shù)較 A 組增加 35%，表明雙波協(xié)同技術(shù)有效增強(qiáng)了外源 DNA 的跨膜遞送效率。其核心機(jī)制在于：方波脈沖快速建立跨膜電場(chǎng)誘導(dǎo)膜孔形成，指數(shù)波脈沖持續(xù)優(yōu)化電場(chǎng)分布，促進(jìn)質(zhì)粒 DNA 向細(xì)胞質(zhì)的定向遷移，同時(shí)避免單一方波可能導(dǎo)致的細(xì)胞膜不可逆損傷。

4.2 蛋白表達(dá)量與可溶性分析

SDS-PAGE 電泳顯示，實(shí)驗(yàn)組在誘導(dǎo)后 4 小時(shí)出現(xiàn)明顯的目的蛋白條帶，分子量約 38kDa，與理論值一致。通過(guò) ImageJ 軟件分析，實(shí)驗(yàn)組可溶性蛋白占總表達(dá)量的 65%，顯著高于 A 組的 42% 與 B 組的 30%（圖 2）。Bradford 法測(cè)定結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組每升培養(yǎng)物可獲得 21.5mg 可溶性核心蛋白聚糖，較 A 組的 15.2mg 提升 41%，較 B 組的 3.8mg 提升近 5 倍。這得益于 Gene Pulser X2 的電弧防護(hù) 3.0 系統(tǒng)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)脈沖能量波動(dòng)，將電火花發(fā)生概率控制在 0.1% 以下，有效保護(hù)感受態(tài)細(xì)胞的膜完整性，減少轉(zhuǎn)化過(guò)程中的細(xì)胞死亡，從而維持更高的生物活性與表達(dá)能力。

4.3 蛋白活性與結(jié)構(gòu)表征

通過(guò) ELISA 法檢測(cè)核心蛋白聚糖與 Ⅰ 型膠原的結(jié)合活性，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組純化蛋白的結(jié)合常數(shù)（Kd）為 2.3×10??M，與天然蛋白（2.0×10??M）基本一致，而 A 組與 B 組因包涵體形成導(dǎo)致活性顯著降低（Kd 分別為 5.8×10??M 和 8.1×10??M）。圓二色譜分析顯示，實(shí)驗(yàn)組蛋白的 α- 螺旋含量為 32%，β- 折疊含量為 28%，二級(jí)結(jié)構(gòu)完整性優(yōu)于對(duì)照組，進(jìn)一步證明威尼德電穿孔儀在低損傷轉(zhuǎn)化方面的優(yōu)勢(shì)，有效減少了因細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致的蛋白錯(cuò)誤折疊。

5. 技術(shù)優(yōu)勢(shì)與關(guān)鍵參數(shù)協(xié)同

威尼德 Gene Pulser X2 在本研究中展現(xiàn)出三大核心技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

雙波協(xié)同精準(zhǔn)適配：針對(duì)大腸桿菌等原核細(xì)胞的厚細(xì)胞壁特性，方波與指數(shù)波的智能切換實(shí)現(xiàn)了膜通透性的動(dòng)態(tài)調(diào)控，脈沖波形的毫秒級(jí)參數(shù)響應(yīng)確保了不同批次轉(zhuǎn)化效率的高度穩(wěn)定（批次間 RSD≤2%）。

智能預(yù)優(yōu)化系統(tǒng)提效：內(nèi)置的 E.coli 等原核細(xì)胞株數(shù)據(jù)庫(kù)，無(wú)需人工摸索電壓 - 脈沖次數(shù)組合，5 分鐘內(nèi)完成新菌株的參數(shù)預(yù)判，較傳統(tǒng)電穿孔儀節(jié)省 70% 的預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

模塊化設(shè)計(jì)拓展應(yīng)用：適配 96 孔板的電極槽設(shè)計(jì)，支持高通量轉(zhuǎn)化篩選，結(jié)合開(kāi)放 API 接口，可與自動(dòng)化工作站聯(lián)機(jī)運(yùn)行，滿足大規(guī)模重組蛋白生產(chǎn)的工藝開(kāi)發(fā)需求。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，電轉(zhuǎn)緩沖液的離子強(qiáng)度、細(xì)胞濃度與脈沖參數(shù)之間存在嚴(yán)格的協(xié)同關(guān)系。當(dāng)細(xì)胞濃度高于 1.5×101?CFU/mL 時(shí)，需通過(guò)儀器的電阻預(yù)檢功能自動(dòng)降低脈沖電壓，避免細(xì)胞團(tuán)聚導(dǎo)致的局部電場(chǎng)不均；而甘油濃度的微小變化（±1%）可通過(guò)儀器的智能校準(zhǔn)系統(tǒng)實(shí)時(shí)補(bǔ)償，確保轉(zhuǎn)化效率穩(wěn)定。這些細(xì)節(jié)體現(xiàn)了 Gene Pulser X2 在復(fù)雜實(shí)驗(yàn)環(huán)境中的精準(zhǔn)控制能力。

6. 應(yīng)用前景

6.1 規(guī)模化蛋白生產(chǎn)工藝開(kāi)發(fā)

本研究建立的電穿孔優(yōu)化技術(shù)可直接應(yīng)用于核心蛋白聚糖的工業(yè)化生產(chǎn)，結(jié)合高密度發(fā)酵工藝與威尼德電穿孔儀的高通量處理能力（單批次可處理 96 個(gè)樣本），有望將生產(chǎn)成本降低 60% 以上。其電弧防護(hù)系統(tǒng)與參數(shù)可追溯性，為 GMP 車(chē)間的質(zhì)量控制提供了可靠保障，滿足生物制藥對(duì)重組蛋白生產(chǎn)的嚴(yán)苛要求。

6.2 難表達(dá)蛋白原核表達(dá)突破

針對(duì)富含二硫鍵、易形成包涵體的復(fù)雜蛋白，Gene Pulser X2 的低損傷轉(zhuǎn)化特性可顯著提升可溶性表達(dá)水平。例如在抗體片段、細(xì)胞因子等藥物蛋白的表達(dá)中，通過(guò)預(yù)設(shè)的 "原核細(xì)胞可溶性表達(dá)" 程序，可快速建立高效表達(dá)體系，縮短從基因克隆到中試生產(chǎn)的周期。

6.3 合成生物學(xué)與基因編輯拓展

在 CRISPR-Cas9 基因編輯系統(tǒng)的原核遞送、代謝工程菌株的高通量篩選等領(lǐng)域，威尼德電穿孔儀的雙波協(xié)同技術(shù)展現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)。其支持的極性反轉(zhuǎn)功能與多規(guī)格耗材適配，可滿足不同類型質(zhì)粒、基因組 DNA 甚至 RNA 的遞送需求，成為合成生物學(xué)研究的核心工具。

威尼德 Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀憑借其革命性的雙波協(xié)同技術(shù)、智能防護(hù)系統(tǒng)與數(shù)字化交互設(shè)計(jì)，重新定義了原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化的效率與可靠性。該設(shè)備已通過(guò)國(guó)內(nèi)百余家生物制藥企業(yè)與重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的驗(yàn)證，提供免費(fèi)的菌株專屬參數(shù)優(yōu)化服務(wù)與 7×24 小時(shí)技術(shù)支持，助力科研人員突破重組蛋白表達(dá)瓶頸，加速推動(dòng)基因治療、生物制藥等領(lǐng)域的成果轉(zhuǎn)化。

參考文獻(xiàn)

1. 王艷紅;王桂琴;郝小夏;核心蛋白聚糖原核表達(dá)體系的構(gòu)建[J];中國(guó)藥物與臨床;2006年03期

2. 金元昌;李景鵬;李會(huì)東;周建紅;重組促性腺激素釋放激素基因原核表達(dá)的影響因素[J];湘潭師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2006年02期

3. 李曉波;肖鏡;付瑞;賀爭(zhēng)鳴;B病毒糖蛋白的原核表達(dá)及ELISA檢測(cè)方法的建立[J];實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué);2009年03期

4. 謝鑫;陳美晴;王勇;蔣君梅;任明見(jiàn);蛋白原核表達(dá)技術(shù)在本科開(kāi)放實(shí)驗(yàn)中的設(shè)計(jì)與實(shí)踐[J];科教導(dǎo)刊(中旬刊);2020年29期

5. 楊濤,楊利軍,馮仟佳,程牛亮,牛勃人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子α原核表達(dá)體系的構(gòu)建及表達(dá)[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2004年04期

6. 馬玲玲;馬紅梅;吳霜;王東;李勇;馬臣杰;曾瑾;產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素β1的原核表達(dá)及其抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立[J];中國(guó)生物制品學(xué)雜志;2022年12期

7. 宋濤;李偉濤;彭青;陳宏;尼秀媚;南方菜豆花葉病毒外殼蛋白基因的克隆與原核表達(dá)[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2013年13期

8. 鐘玉玲;代邦國(guó);杜偉偉;張華文;李純;史懷平;奶山羊乳鐵蛋白的原核表達(dá)及其多克隆抗體的制備[J];;2022年02期

9. 王瓊秀;周菁;離子交換層析法純化原核表達(dá)的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白[J];中國(guó)藥業(yè);2013年10期

10. 宋述梅,壽成超原核表達(dá)的可溶性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子活性的抑制[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2000年03期