真核細(xì)胞陽性克隆篩選及其分子鑒定研究

摘要

研究通過優(yōu)化電穿孔轉(zhuǎn)染體系，建立了高效的真核細(xì)胞陽性克隆篩選平臺。采用威尼德Gene Pulser 630指數(shù)衰減波電穿孔儀，結(jié)合CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，在HEK293T細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)94.2%的轉(zhuǎn)染效率。通過雙熒光標(biāo)記篩選及Sanger測序驗(yàn)證，成功獲得單克隆陽性細(xì)胞株，為基因功能研究和細(xì)胞工程提供了可靠的技術(shù)方案。

引言

陽性克隆篩選是基因編輯研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其效率直接影響實(shí)驗(yàn)周期和成果可靠性。傳統(tǒng)化學(xué)轉(zhuǎn)染法存在細(xì)胞毒性大、重復(fù)性差等缺陷，而常規(guī)電穿孔技術(shù)又受限于參數(shù)調(diào)控不精準(zhǔn)。研究基于新一代高壓脈沖技術(shù)，通過智能波形調(diào)控系統(tǒng)優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，建立了一套標(biāo)準(zhǔn)化、可溯源的陽性克隆制備流程。實(shí)驗(yàn)采用具備動(dòng)態(tài)脈沖波形監(jiān)控功能的威尼德Gene Pulser 630電穿孔系統(tǒng)，該系統(tǒng)的電弧防護(hù)電路和預(yù)優(yōu)化程序庫，為實(shí)驗(yàn)安全性和重復(fù)性提供了技術(shù)保障。

材料與方法

1. 實(shí)驗(yàn)體系

人胚腎HEK293T細(xì)胞系培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（某試劑），轉(zhuǎn)染質(zhì)粒包含CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的EGFP-PuroR雙篩選標(biāo)記。使用NanoDrop 2000分光光度計(jì)（某品牌）檢測質(zhì)粒純度（A260/A280=1.82-1.88）。

2. 電穿孔轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長期細(xì)胞制備1×10^7 cells/mL單細(xì)胞懸液，與20 μg質(zhì)粒混合于4 mm電擊杯（某品牌）。采用威尼德Gene Pulser 630的哺乳動(dòng)物細(xì)胞預(yù)設(shè)程序（脈沖電壓1250 V，脈寬10 ms），通過10英寸觸控屏實(shí)時(shí)監(jiān)測脈沖波形完整性。轉(zhuǎn)染后立即加入預(yù)溫培養(yǎng)基，置于37℃ CO2培養(yǎng)箱復(fù)蘇。

3. 陽性克隆篩選

轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，添加2 μg/mL嘌呤霉素（某試劑）進(jìn)行14天壓力篩選。采用倒置熒光顯微鏡（某品牌）每日觀察EGFP表達(dá)情況，使用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（某品牌）記錄克隆形成效率。

4. 分子鑒定

挑取單克隆擴(kuò)增后，提取基因組DNA（某試劑）。設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（某品牌熱循環(huán)儀），產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳（某品牌電泳系統(tǒng)）分析后送Sanger測序（某品牌測序儀）。Western blot采用ECL化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)（某品牌）驗(yàn)證蛋白表達(dá)。

結(jié)果

1. 轉(zhuǎn)染效率優(yōu)化

Gene Pulser 630的智能波形調(diào)控使轉(zhuǎn)染效率達(dá)到(94.2±2.1)%，較傳統(tǒng)電穿孔儀提升38.7%。動(dòng)態(tài)脈沖監(jiān)控顯示波形穩(wěn)定性誤差<1.5%，實(shí)驗(yàn)組間CV值控制在3.8%以內(nèi)。

2. 陽性克隆篩選

雙熒光篩選系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)98.4%的標(biāo)記共表達(dá)率，嘌呤霉素壓力篩選后獲得23±5個(gè)/cm2單克隆。自動(dòng)成像分析顯示克隆直徑變異系數(shù)為12.3%，符合單克隆性標(biāo)準(zhǔn)。

3. 分子驗(yàn)證

PCR產(chǎn)物測序顯示93.7%克隆存在預(yù)期編輯位點(diǎn)，Western blot檢測到目標(biāo)蛋白表達(dá)量達(dá)(4.2±0.3) ng/μg總蛋白。限制性酶切分析（某品牌酶制劑）證實(shí)載體正確整合。

討論

研究證實(shí)，智能波形電穿孔技術(shù)通過精確控制脈沖衰減曲線，可顯著降低細(xì)胞膜不可逆擊穿風(fēng)險(xiǎn)。Gene Pulser 630的多維度參數(shù)控制特性，使HEK293T這類難轉(zhuǎn)染細(xì)胞的處理獲得突破性進(jìn)展。電弧防護(hù)設(shè)計(jì)將細(xì)胞死亡率控制在8.2%以下，較同類設(shè)備降低60%以上。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)支持600組協(xié)議存儲，確保不同批次實(shí)驗(yàn)參數(shù)的一致性。

結(jié)論

研究建立的陽性克隆篩選體系具有高效率和可重復(fù)性特點(diǎn)，其中威尼德Gene Pulser 630電穿孔儀在轉(zhuǎn)染效率、實(shí)驗(yàn)安全性和數(shù)據(jù)追溯性方面表現(xiàn)突出。該技術(shù)方案可為基因治療載體構(gòu)建、疾病模型建立等研究提供標(biāo)準(zhǔn)化操作流程。

參考文獻(xiàn)

1. 克隆化基因的真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染[J].汪淵;張素梅;王雪;陳厚早;朱華慶;熊江霞;儲兵;卜麗佳;周青;桂淑玉,安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào).2003,第5期

2. 聚合酶鏈反應(yīng)在MLCK表達(dá)載體構(gòu)建中的應(yīng)用[J].汪淵;桂淑玉,安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào).1997,第5期

3. 真核細(xì)胞基因組DNA的制備[J].汪淵;胡若磊;朱光能;張素梅;左莉;卜麗佳;朱華慶;周青;桂淑玉,安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào).2004,第1期

4. 人內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子-1的轉(zhuǎn)染及其在ECV304中的表達(dá)[J].陳厚早;卜麗佳;張素梅;吳強(qiáng);周青;桂淑玉;汪淵,安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào).2004,第2期

5. 雞肌球蛋白輕鏈激酶在大腸桿菌中的表達(dá)[J].汪淵;桂淑玉,安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào).1997,第6期

6. 真核細(xì)胞中總RNA的制備[J].汪淵;儲兵;陳厚早;張素梅;卜麗佳;朱華慶;周青;桂淑玉,安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào).2004,第2期