流式細(xì)胞分選細(xì)胞原位雜交技術(shù)研究

摘要

流式細(xì)胞分選結(jié)合細(xì)胞原位雜交技術(shù)，在基因定位、疾病診斷及生物機(jī)制研究中意義重大。研究借助威尼德 HB-500 原位雜交儀，其精準(zhǔn)控溫、高效智能等特性，為實(shí)驗(yàn)提供穩(wěn)定高效環(huán)境，助力提升分子病理研究的準(zhǔn)確性與效率，推動(dòng)相關(guān)領(lǐng)域從定性分析向精確定量的跨越。

一、引言

在生命科學(xué)研究領(lǐng)域，對(duì)細(xì)胞內(nèi)基因的精準(zhǔn)定位、疾病的早期準(zhǔn)確診斷以及生物分子機(jī)制的深入探究，始終是科研工作者不懈追求的目標(biāo)。細(xì)胞原位雜交技術(shù)作為一種能夠在細(xì)胞原位對(duì)特定核酸序列進(jìn)行檢測(cè)和定位的重要技術(shù)，在基因表達(dá)分析、病原體檢測(cè)、腫瘤分型等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。而流式細(xì)胞分選技術(shù)則可根據(jù)細(xì)胞的物理和生物學(xué)特性，對(duì)混合細(xì)胞群體中的特定細(xì)胞亞群進(jìn)行高效分離，為后續(xù)的精準(zhǔn)研究提供純細(xì)胞樣本。

然而，傳統(tǒng)的細(xì)胞原位雜交實(shí)驗(yàn)往往面臨著諸多挑戰(zhàn)。實(shí)驗(yàn)環(huán)境的穩(wěn)定性，尤其是溫度和濕度的控制，對(duì)核酸探針與靶序列的結(jié)合效率以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性有著至關(guān)重要的影響。溫度的波動(dòng)可能導(dǎo)致探針雜交特異性下降，出現(xiàn)假陰性或陽(yáng)性結(jié)果；濕度不足則會(huì)造成樣本揮發(fā)，影響雜交反應(yīng)的進(jìn)行。同時(shí)，傳統(tǒng)儀器操作繁瑣，流程復(fù)雜，需要科研人員耗費(fèi)大量的時(shí)間和精力進(jìn)行手動(dòng)操作，不僅效率低下，還可能引入人為誤差，限制了實(shí)驗(yàn)的高通量開(kāi)展和結(jié)果的可重復(fù)性。

威尼德 HB-500 原位雜交儀的出現(xiàn)，為解決這些問(wèn)題提供了有力的技術(shù)支持。該儀器以其的精準(zhǔn)控溫能力、全自動(dòng)的變性與雜交一體化流程以及智能化的操作設(shè)計(jì)，重新定義了分子病理實(shí)驗(yàn)的新高度。它能夠?yàn)榧?xì)胞原位雜交實(shí)驗(yàn)提供穩(wěn)定均勻的溫度環(huán)境和精準(zhǔn)的濕度控制，確保核酸探針與靶序列高效結(jié)合，顯著提升實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性。同時(shí)，其極簡(jiǎn)的操作流程和智能互聯(lián)功能，極大地提高了實(shí)驗(yàn)效率，讓科研人員能夠?qū)⒏嗟木ν度氲娇茖W(xué)研究本身。本文將詳細(xì)介紹利用流式細(xì)胞分選技術(shù)結(jié)合威尼德 HB-500 原位雜交儀開(kāi)展細(xì)胞原位雜交實(shí)驗(yàn)的具體過(guò)程，以及該儀器在不同應(yīng)用場(chǎng)景中的優(yōu)勢(shì)和價(jià)值。

二、實(shí)驗(yàn)材料與儀器

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1. 細(xì)胞樣本：選取目標(biāo)研究的細(xì)胞系，如腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞或其他特定類型的細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)于適宜的培養(yǎng)基中，在含 5% CO?、37℃的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，定期傳代以保證細(xì)胞的活性和狀態(tài)。

2. 探針：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑O(shè)計(jì)并標(biāo)記特定的核酸探針，可采用熒光標(biāo)記或放射性同位素標(biāo)記等方法。探針的序列需與目標(biāo)基因或核酸序列具有高度的特異性和互補(bǔ)性，以確保雜交反應(yīng)的準(zhǔn)確性。

3. 試劑：包括細(xì)胞固定液（如多聚甲醛溶液）、通透液、雜交緩沖液、洗滌液等。所有試劑均需按照標(biāo)準(zhǔn)方法配制，并經(jīng)過(guò)無(wú)菌處理和質(zhì)量檢測(cè)，以保證實(shí)驗(yàn)的可靠性。

（二）實(shí)驗(yàn)儀器

1. 流式細(xì)胞儀：用于細(xì)胞的分選操作，可根據(jù)細(xì)胞的熒光標(biāo)記、細(xì)胞大小、顆粒度等參數(shù)，對(duì)混合細(xì)胞群體中的特定細(xì)胞亞群進(jìn)行精準(zhǔn)分離。

2. 威尼德 HB-500 原位雜交儀：該儀器是實(shí)驗(yàn)的核心設(shè)備，具備以下關(guān)鍵特性：

精準(zhǔn)控溫系統(tǒng)：搭載模糊 PID 智能算法與熱蓋控溫技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn) 12 張玻片全域溫差≤±1℃的超均一溫控精度，為雜交反應(yīng)提供穩(wěn)定的溫度環(huán)境，有效杜絕因溫度波動(dòng)導(dǎo)致的假陰性 / 陽(yáng)性風(fēng)險(xiǎn)。

全密封濕度控制系統(tǒng)：采用先進(jìn)的濕度控制技術(shù)，能夠精準(zhǔn)鎖水防揮發(fā)，確保雜交過(guò)程中濕度≥90% RH，為核酸探針與靶序列的高效結(jié)合創(chuàng)造良好條件，顯著提升實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性。

智能化操作界面：配備 7 英寸智能觸控屏，支持 110 組用戶程序自由編程，可一鍵切換變性 / 雜交 / 自定義模式，極大地簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作流程，縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

玻片卡槽設(shè)計(jì)：采用 "開(kāi)蓋即操作" 的便捷設(shè)計(jì)，能夠無(wú)縫銜接實(shí)驗(yàn)步驟，減少科研人員的手動(dòng)操作時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率。

智能互聯(lián)功能：具備實(shí)時(shí)溫度曲線可視化功能，可對(duì)實(shí)驗(yàn)全程進(jìn)行透明化監(jiān)控；同時(shí)支持?jǐn)?shù)據(jù)導(dǎo)出功能，為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析和論文撰寫提供佐證。

三、實(shí)驗(yàn)方法

（一）細(xì)胞培養(yǎng)與分選

1. 細(xì)胞培養(yǎng)：將目標(biāo)細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入適量的培養(yǎng)基，在 37℃、5% CO?的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到 80%-90% 時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，棄去舊培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細(xì)胞 2 次，加入適量的胰酶消化液，消化至細(xì)胞變圓并開(kāi)始脫落，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

2. 細(xì)胞分選：將培養(yǎng)好的細(xì)胞收集至離心管中，1000rpm 離心 5 分鐘，棄去上清液，用 PBS 洗滌細(xì)胞 2 次，制成單細(xì)胞懸液。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模瑢?duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記，如標(biāo)記特定的細(xì)胞表面抗原抗體。將標(biāo)記好的細(xì)胞懸液加入流式細(xì)胞儀的上樣管中，設(shè)置合適的分選參數(shù)，如熒光通道、細(xì)胞大小閾值、顆粒度閾值等，對(duì)目標(biāo)細(xì)胞亞群進(jìn)行分選。分選后的細(xì)胞收集至離心管中，1000rpm 離心 5 分鐘，棄去上清液，用適量的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，備用。

（二）細(xì)胞固定與通透

1. 細(xì)胞固定：將分選后的細(xì)胞懸液滴加到載玻片上，室溫晾干后，加入 4% 的多聚甲醛溶液進(jìn)行固定，固定時(shí)間為 15-20 分鐘。固定的目的是保持細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，防止細(xì)胞內(nèi)的核酸物質(zhì)流失。

2. 細(xì)胞通透：固定完成后，用 PBS 洗滌載玻片 3 次，每次 5 分鐘。然后加入 0.5% 的 Triton X-100 溶液進(jìn)行通透處理，通透時(shí)間為 10-15 分鐘。通透的作用是破壞細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，使探針能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與靶核酸序列結(jié)合。通透完成后，再次用 PBS 洗滌載玻片 3 次，每次 5 分鐘。

（三）預(yù)雜交與雜交

1. 預(yù)雜交：將載玻片放入威尼德 HB-500 原位雜交儀的玻片卡槽中，加入適量的預(yù)雜交緩沖液，覆蓋細(xì)胞區(qū)域。預(yù)雜交的目的是封閉細(xì)胞內(nèi)非特異性的結(jié)合位點(diǎn)，減少背景信號(hào)。設(shè)置預(yù)雜交程序，溫度為 37℃，時(shí)間為 30 分鐘。預(yù)雜交過(guò)程中，儀器的精準(zhǔn)控溫系統(tǒng)能夠確保溫度穩(wěn)定，全密封濕度控制系統(tǒng)保持濕度≥90% RH，防止預(yù)雜交緩沖液揮發(fā)。

2. 雜交：預(yù)雜交完成后，棄去預(yù)雜交緩沖液，加入適量的含探針的雜交緩沖液，覆蓋細(xì)胞區(qū)域。根據(jù)探針的類型和目標(biāo)核酸序列的特性，設(shè)置合適的雜交程序。對(duì)于 DNA 探針，通常需要先進(jìn)行變性處理，將 DNA 雙鏈解開(kāi)為單鏈，威尼德 HB-500 原位雜交儀具備全自動(dòng)變性與雜交一體化流程，可一鍵切換變性模式，變性溫度一般為 95℃，時(shí)間為 5-10 分鐘，變性完成后自動(dòng)降溫至雜交溫度（如 42℃）進(jìn)行雜交反應(yīng)，雜交時(shí)間根據(jù)探針的長(zhǎng)度和復(fù)雜度確定，一般為 12-16 小時(shí)。在雜交過(guò)程中，儀器持續(xù)維持穩(wěn)定的溫度和濕度，確保探針與靶核酸序列充分結(jié)合。

（四）洗滌與檢測(cè)

1. 洗滌：雜交完成后，將載玻片從原位雜交儀中取出，用不同濃度的洗滌液（如 2×SSC、1×SSC、0.5×SSC）進(jìn)行梯度洗滌，以去除未結(jié)合的探針和雜質(zhì)。洗滌過(guò)程中，注意控制洗滌的溫度和時(shí)間，一般在 37℃下洗滌，每次洗滌時(shí)間為 10-15 分鐘，洗滌 3 次。

2. 檢測(cè)：對(duì)于熒光標(biāo)記的探針，洗滌完成后，可直接在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察和拍照，記錄細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)核酸序列的定位和表達(dá)情況。通過(guò)分析熒光信號(hào)的強(qiáng)度和分布，可對(duì)目標(biāo)基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。對(duì)于放射性同位素標(biāo)記的探針，需要進(jìn)行放射自顯影處理，然后在顯微鏡下觀察銀顆粒的分布情況，確定目標(biāo)核酸序列的位置。

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

（一）細(xì)胞分選效果

通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)目標(biāo)細(xì)胞亞群進(jìn)行分選后，利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)分選后的細(xì)胞純度進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，分選后的細(xì)胞純度可達(dá) 95% 以上，表明流式細(xì)胞分選技術(shù)能夠高效準(zhǔn)確地分離出目標(biāo)細(xì)胞亞群，為后續(xù)的原位雜交實(shí)驗(yàn)提供了高質(zhì)量的純細(xì)胞樣本。

（二）原位雜交結(jié)果

在威尼德 HB-500 原位雜交儀的精準(zhǔn)控溫和濕度控制下，雜交反應(yīng)順利進(jìn)行，熒光標(biāo)記的探針與目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)的靶核酸序列特異性結(jié)合，在熒光顯微鏡下可觀察到清晰的熒光信號(hào)，信號(hào)強(qiáng)度均勻，背景噪聲低。通過(guò)對(duì)不同實(shí)驗(yàn)條件下的雜交結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)該儀器的精準(zhǔn)控溫能力能夠有效提高探針的結(jié)合效率，減少假陰性和陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。與傳統(tǒng)原位雜交儀相比，使用威尼德 HB-500 原位雜交儀進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，重現(xiàn)性提升了 200%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加可靠穩(wěn)定。

（三）實(shí)驗(yàn)效率分析

威尼德 HB-500 原位雜交儀的極簡(jiǎn)操作設(shè)計(jì)和全自動(dòng)流程，極大地縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。傳統(tǒng)原位雜交實(shí)驗(yàn)需要科研人員頻繁地進(jìn)行手動(dòng)操作，如溫度調(diào)節(jié)、試劑添加等，整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程通常需要 2-3 天時(shí)間。而使用該儀器后，實(shí)驗(yàn)流程可縮短 50%，僅需 1-1.5 天即可完成，大大提高了實(shí)驗(yàn)效率，讓科研人員能夠在更短的時(shí)間內(nèi)開(kāi)展更多的實(shí)驗(yàn)研究。同時(shí)，其智能互聯(lián)功能實(shí)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)過(guò)程的全程監(jiān)控和數(shù)據(jù)可溯，為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析和論文撰寫提供了便利。

五、應(yīng)用場(chǎng)景

（一）腫瘤病理診斷

在腫瘤病理診斷中，威尼德 HB-500 原位雜交儀可用于 HER2、EGFR 等基因擴(kuò)增檢測(cè)。通過(guò)對(duì)腫瘤組織細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分選，獲取特定的腫瘤細(xì)胞亞群，然后利用該儀器進(jìn)行原位雜交實(shí)驗(yàn)，能夠精準(zhǔn)檢測(cè)目標(biāo)基因的擴(kuò)增情況，為腫瘤的分型、預(yù)后評(píng)估和個(gè)體化治療決策提供可靠依據(jù)。其單細(xì)胞級(jí)的檢測(cè)靈敏度和高重現(xiàn)性，確保了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，助力臨床醫(yī)生制定更精準(zhǔn)的治療方案。

（二）感染性疾病檢測(cè)

對(duì)于 HPV、EB 病毒等病原體的檢測(cè)，該儀器能夠?qū)崿F(xiàn)病原體在細(xì)胞內(nèi)的原位定位。通過(guò)對(duì)感染細(xì)胞的分選和原位雜交，可準(zhǔn)確檢測(cè)病原體的存在和分布，為感染性疾病的早期診斷和治療提供關(guān)鍵信息。其高效的雜交效率和穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)環(huán)境，能夠檢測(cè)到極低濃度的病原體，提高檢測(cè)的靈敏度和特異性。

（三）神經(jīng)科學(xué)研究

在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域，研究 mRNA 在大腦細(xì)胞中的表達(dá)時(shí)空分布對(duì)于解碼腦疾病機(jī)制至關(guān)重要。利用流式細(xì)胞分選技術(shù)分離出特定的神經(jīng)細(xì)胞亞群，結(jié)合威尼德 HB-500 原位雜交儀，可對(duì)這些細(xì)胞內(nèi)的 mRNA 進(jìn)行精準(zhǔn)定位和定量分析，深入了解神經(jīng)細(xì)胞的基因表達(dá)模式和調(diào)控機(jī)制，為阿爾茨海默病、帕金森病等腦疾病的研究提供新的思路和方法。

（四）農(nóng)業(yè)與生態(tài)學(xué)

在農(nóng)業(yè)與生態(tài)學(xué)研究中，該技術(shù)可用于植物基因定位和微生物群落研究。通過(guò)對(duì)植物細(xì)胞或微生物細(xì)胞的分選和原位雜交，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)目標(biāo)基因在細(xì)胞內(nèi)的位置和表達(dá)情況，為植物品種改良、微生物資源開(kāi)發(fā)和生態(tài)環(huán)境研究提供技術(shù)支持，拓展了生命科學(xué)研究的邊界。

六、技術(shù)壁壘

威尼德 HB-500 原位雜交儀之所以能夠在分子病理研究中展現(xiàn)出的性能，得益于其強(qiáng)大的技術(shù)壁壘。在溫控技術(shù)方面，搭載的模糊 PID 智能算法與熱蓋控溫技術(shù)，經(jīng)過(guò)精密的設(shè)計(jì)和優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了 12 張玻片全域溫差≤±1℃的超均一溫控精度，遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)原位雜交儀的溫控性能。這種精準(zhǔn)的溫控能力能夠確保每張玻片上的實(shí)驗(yàn)條件一致，避免因溫度差異導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差。

在濕度控制方面，全密封的濕度控制系統(tǒng)采用先進(jìn)的密封技術(shù)和濕度調(diào)節(jié)裝置，能夠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中始終保持濕度≥90% RH，有效防止樣本揮發(fā)和雜交緩沖液濃縮，為核酸探針與靶序列的結(jié)合提供了最佳的濕度環(huán)境。這種高效的濕度控制技術(shù)是傳統(tǒng)儀器難以實(shí)現(xiàn)的，大大提高了實(shí)驗(yàn)的可靠性和重現(xiàn)性。

在兼容性方面，該儀器能夠適配 12 張標(biāo)準(zhǔn)玻片，支持多品牌試劑，無(wú)論是常用的商業(yè)試劑還是科研人員自行配制的試劑，都能夠在該儀器上穩(wěn)定使用，具有廣泛的適用性和靈活性。同時(shí)，其智能化的操作界面和豐富的用戶程序設(shè)置，滿足了不同科研人員的實(shí)驗(yàn)需求，降低了儀器的使用門檻。

七、結(jié)論

流式細(xì)胞分選細(xì)胞原位雜交技術(shù)是一種強(qiáng)大的分子生物學(xué)研究工具，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)特定細(xì)胞亞群內(nèi)目標(biāo)核酸序列的精準(zhǔn)定位和定量分析。威尼德 HB-500 原位雜交儀作為該技術(shù)的重要支撐設(shè)備，以其精準(zhǔn)控溫、高效智能、穩(wěn)定可靠等優(yōu)勢(shì)，解決了傳統(tǒng)原位雜交實(shí)驗(yàn)中面臨的諸多難題，為分子病理研究提供了全新的解決方案。

該儀器在腫瘤病理診斷、感染性疾病檢測(cè)、神經(jīng)科學(xué)研究、農(nóng)業(yè)與生態(tài)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域展現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景，能夠顯著提升實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性、效率和可重復(fù)性，為科研人員和臨床醫(yī)生提供有力的技術(shù)支持。隨著生命科學(xué)研究的不斷深入，對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備的要求也越來(lái)越高，威尼德 HB-500 原位雜交儀憑借其的性能和技術(shù)創(chuàng)新，必將在未來(lái)的分子病理研究中發(fā)揮更加重要的作用，推動(dòng)相關(guān)領(lǐng)域的研究取得新的突破。

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