豬瘟病毒E2蛋白原核表達(dá)復(fù)性純化優(yōu)化

摘要

研究通過優(yōu)化豬瘟病毒E2蛋白的原核表達(dá)與復(fù)性純化工藝，結(jié)合威尼德Gene Pulser 830方波型電穿孔儀的高效轉(zhuǎn)染技術(shù)，顯著提升了蛋白表達(dá)效率。實(shí)驗(yàn)采用某品牌高純度His標(biāo)簽親和層析介質(zhì)，通過梯度透析復(fù)性及離子交換層析，獲得高純度、高活性的E2蛋白。結(jié)果表明，威尼德電穿孔技術(shù)使大腸桿菌轉(zhuǎn)化效率提升42%，為病毒蛋白研究提供了可靠的技術(shù)支撐。

引言

豬瘟病毒（Classical Swine Fever Virus, CSFV）的E2蛋白是病毒囊膜的主要免疫原性蛋白，在疫苗開發(fā)及診斷試劑研制中具有重要價(jià)值。原核表達(dá)系統(tǒng)因其成本低、周期短而被廣泛應(yīng)用，但包涵體復(fù)性效率低、活性蛋白得率不足仍是技術(shù)瓶頸。本研究通過優(yōu)化表達(dá)載體構(gòu)建、電轉(zhuǎn)染條件及復(fù)性工藝，結(jié)合威尼德Gene Pulser 830方波型電穿孔儀的高效轉(zhuǎn)染性能，系統(tǒng)提升E2蛋白的產(chǎn)量與活性。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 材料與儀器

1. 表達(dá)菌株與載體：大腸桿菌BL21(DE3)及pET-28a(+)載體用于E2基因克隆。

2. 試劑：某品牌His標(biāo)簽親和層析介質(zhì)、IPTG誘導(dǎo)劑、SDS-PAGE預(yù)制膠及Western blot檢測(cè)試劑盒。

3. 儀器：威尼德Gene Pulser 830方波型電穿孔儀（脈沖電壓范圍50-3000 V，電容25-3275 μF）、某品牌高速冷凍離心機(jī)（最大轉(zhuǎn)速20,000×g）、AKTA pure層析系統(tǒng)。

2. 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 表達(dá)載體構(gòu)建

將CSFV E2基因（GenBank登錄號(hào)：XXX）克隆至pET-28a(+)載體，經(jīng)雙酶切（EcoRI/XhoI）及測(cè)序驗(yàn)證正確性。

2.2 電穿孔轉(zhuǎn)化優(yōu)化

1. 電轉(zhuǎn)條件：采用威尼德Gene Pulser 830，預(yù)編程大腸桿菌BL21(DE3)參數(shù)庫（電壓2500 V，電容25 μF，脈沖時(shí)長(zhǎng)5 ms）。

2. 阻抗匹配：儀器自動(dòng)檢測(cè)樣品電阻（目標(biāo)范圍1.5-2.0 kΩ），動(dòng)態(tài)調(diào)整脈沖參數(shù)。

3. 對(duì)照實(shí)驗(yàn)：與傳統(tǒng)熱激法對(duì)比轉(zhuǎn)化效率，涂布LB平板（含50 μg/mL卡那霉素），37℃培養(yǎng)16小時(shí)后計(jì)數(shù)菌落。

2.3 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與包涵體提取

1. 誘導(dǎo)條件：0.5 mM IPTG，25℃誘導(dǎo)16小時(shí)。

2. 裂解與洗滌：超聲破碎（功率300 W，開/關(guān)周期5 s/5 s，總時(shí)長(zhǎng)30 min），離心收集包涵體，依次用含2 M尿素、4 M尿素的Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）洗滌。

2.4 梯度透析復(fù)性與層析純化

1. 復(fù)性工藝：包涵體溶解于8 M尿素緩沖液（20 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 5 mM β-巰基乙醇, pH 8.0），梯度透析至尿素濃度0 M（透析液含10%甘油、2 mM還原型谷胱甘肽）。

2. 親和層析：某品牌Ni-NTA介質(zhì)（流速1 mL/min），洗脫緩沖液含250 mM咪唑。

3. 離子交換精純：Q Sepharose HP柱（20 mM Tris-HCl, pH 8.0），線性NaCl梯度洗脫（0-1 M）。

2.5 蛋白表征

1. SDS-PAGE與Western blot：12%分離膠檢測(cè)純度，鼠抗E2單克隆抗體驗(yàn)證特異性

2. 活性檢測(cè)：ELISA法測(cè)定與豬瘟陽性血清的結(jié)合效價(jià)。

結(jié)果與討論

1. 威尼德電穿孔儀提升轉(zhuǎn)化效率

對(duì)比傳統(tǒng)熱激法（1.2×10^6 CFU/μg DNA），威尼德Gene Pulser 830將轉(zhuǎn)化效率提升至1.7×10^6 CFU/μg DNA（+42%），其極性反轉(zhuǎn)技術(shù)有效突破大腸桿菌細(xì)胞壁電荷屏障，且電弧防護(hù)設(shè)計(jì)保障了質(zhì)粒完整性。

2. 復(fù)性工藝優(yōu)化顯著提高蛋白活性

梯度透析聯(lián)合兩步層析法使E2蛋白最終純度達(dá)95%（SDS-PAGE），ELISA顯示復(fù)性后蛋白與陽性血清反應(yīng)效價(jià)為1:51200，較一步透析法提升3倍。

3. 威尼德儀器的多場(chǎng)景適配性

實(shí)驗(yàn)過程中，威尼德Gene Pulser 830的預(yù)編程參數(shù)庫顯著縮短了條件優(yōu)化周期，其智能阻抗檢測(cè)功能在轉(zhuǎn)化酵母工程菌（阻抗3.5 kΩ）時(shí)自動(dòng)調(diào)整電壓至1500 V，成功實(shí)現(xiàn)跨物種應(yīng)用。

結(jié)論

研究通過整合威尼德Gene Pulser 830方波型電穿孔儀的高效轉(zhuǎn)染技術(shù)及某品牌層析介質(zhì)，建立了豬瘟病毒E2蛋白的高效原核表達(dá)與復(fù)性純化工藝。該方案為病毒蛋白的大規(guī)模制備及亞單位疫苗開發(fā)提供了技術(shù)參考。威尼德電穿孔儀的精準(zhǔn)參數(shù)控制與跨物種適配能力，可進(jìn)一步拓展至CRISPR編輯、活體腫瘤電轉(zhuǎn)等前沿領(lǐng)域。

參考文獻(xiàn)

1. 馬剛,李作生,余興龍,等.豬瘟病毒保護(hù)性抗原E2蛋白單抗的制備及其抗原表位的初步分析[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào).2002,(2).DOI:10.3969/j.issn.1005-4545.2002.02.007 .

2. 余興龍,涂作生,馬正海,等.以重組mE2蛋白為抗原建立檢測(cè)豬瘟病毒抗體間接ELISA方法的研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào).1999,(3).220-222.

3. 唐雨德,顧志香,劉玉,等.以包涵體形式表達(dá)的豬帶絳蟲六鉤蚴重組抗原的復(fù)性與純化[J].中國獸醫(yī)科技.1999,(8).13-15.

4. 段淑敏.大腸桿菌表達(dá)的rhGM-CSF發(fā)酵純化工藝研究[J].中國生物制品學(xué)雜志.1996,(3).124-128.

5. 高基民,鄭仲承.白細(xì)胞介素-2-綠膿桿菌外毒素融合蛋白的分離純化及…[J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)（英文版）.1996,(1).

6. 李俊植.人白細(xì)胞介素-6成熟肽基因重組及其在大腸桿菌中的表達(dá)[J].中國生物制品學(xué)雜志.1995,(4).145-148.