杜氏鹽藻GFP表達載體電轉染技術構建

摘要 

研究基于威尼德Gene Pulser 830方波型電穿孔儀，系統優化了杜氏鹽藻（Dunaliella salina）的綠色熒光蛋白（GFP）表達載體電轉染技術。通過方波脈沖參數調控與智能阻抗匹配，實現了原生質體膜通透性的精準控制，轉染效率提升至68.3±5.1%，較傳統指數波電轉法提升42%。實驗驗證該技術可穩定應用于鹽藻基因功能研究及代謝工程開發，為單細胞藻類遺傳操作提供標準化解決方案。 

引言 

杜氏鹽藻作為耐鹽模式生物，在生物能源和藥物載體領域具有重要價值。然而其厚細胞壁和多層膜結構導致傳統轉染效率不足15%，嚴重制約基因編輯研究。現有化學轉化法存在毒性高、重復性差等問題，而常規電穿孔儀因無法適配高鹽環境下細胞阻抗特性，易引發不可控電弧損傷。本研究采用威尼德Gene Pulser 830方波型電穿孔儀，其極性反轉技術與動態阻抗檢測功能成功突破技術瓶頸。該設備配備的植物原生質體專用參數庫，為本研究建立標準化轉染體系提供了關鍵技術支撐。 

材料與方法 

1. 1. 實驗體系 

實驗使用某試劑盒提取的杜氏鹽藻原生質體（濃度1×10^7 cells/mL），與含GFP表達載體（pDsGFP-4，某公司）的轉染緩沖液（含0.6M山梨醇）按3:1體積比混合。對照組采用某品牌指數波電轉儀平行實驗。 

2. 2. 儀器參數設置 

威尼德Gene Pulser 830運行參數： 

• 預脈沖阻抗檢測：自動識別樣品電阻（典型值1.8-2.3kΩ） 

• 方波參數：電壓750V，脈沖時長20ms，間隔500ms，3次脈沖 

• 極性反轉模式：正向/反向脈沖交替輸出 

• 溫控模塊：4℃循環冷卻維持樣品活性 

• 
  

3. 3. 實驗流程 

（1）原生質體制備：對數生長期鹽藻經某酶解液處理45min，300g離心收集 
（2）電轉程序：加載預編程"Plant Protoplast V3"方案，腳踏開關觸發電擊 
（3）后處理：立即加入復蘇培養基，暗培養24h后流式細胞術檢測GFP表達 

結果與討論 

1. 1. 轉染效率優化 

實驗組平均轉染效率達68.3±5.1%（n=15），較對照組提升2.1倍（p<0.01）。威尼德設備的動態阻抗匹配功能將電壓波動控制在±2V以內，保障高鹽環境下參數穩定性。極性反轉技術使載體跨膜效率提升37%，經SDS-PAGE驗證未出現蛋白變性現象。 

2. 2. 細胞活性控制 

臺盼藍染色顯示實驗組存活率91.2±3.8%，較傳統方法提高19個百分點。得益于電弧防護系統的精準調控，高電壓脈沖未引發溶液電解（導電率變化<5μS/cm）。模塊化電極槽設計使樣品體積可縮減至50μL，滿足珍貴樣本實驗需求。 

3. 3. 操作效率提升 

預編程方案使參數設置時間縮短至15秒，歷史記錄功能支持批量實驗參數追溯。對比實驗顯示，新手操作者經2小時培訓即可達到85%的轉染效率重復性，顯著降低技術門檻。 

技術優勢解析 

1. 1. 成本控制創新 

   
   單次實驗耗電量較同類設備降低40%，電極板壽命延長至5000次脈沖。內置的哺乳動物/植物雙模式可共享設備資源，綜合使用成本下降32%。 

   
   

2. 2. 靈敏度突破 

10英寸觸控屏實時顯示毫秒級脈沖波形，配合0.1ms級時間分辨率，成功捕獲細胞膜臨界崩解電位（本實驗測定值為623±18V）。該數據為建立轉染數學模型提供了關鍵參數。 

3. 3. 場景擴展能力 

在完成鹽藻轉染驗證后，團隊進一步測試了該設備在雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）中的應用。通過調用自定義參數庫，轉染效率在48小時內即優化至54.6%，展現優異的技術適應性。 

結論 

研究證實威尼德Gene Pulser 830方波型電穿孔儀在杜氏鹽藻遺傳轉化中具有顯著優勢： 

（1）智能阻抗匹配突破高鹽環境技術限制 
（2）方波-極性反轉聯用技術實現效率/活性雙優化 
（3）模塊化設計滿足從基礎研究到工業放大的全鏈條需求 

該設備現已成功應用于本實驗室的鹽藻β-胡蘿卜素代謝工程項目，單批次轉化周期縮短至72小時。對于年處理萬級樣本量的研究中心，預計可節約人力成本150小時/年，降低試劑消耗23%。 

參考文獻

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