摘要

研究通過PCR擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌MPT64基因，構(gòu)建pCDNA3.1-MPT64真核表達(dá)載體，并利用威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。Western blot驗(yàn)證MPT64蛋白高效表達(dá)，ELISA檢測(cè)分泌水平達(dá)2.8 μg/mL。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了載體設(shè)計(jì)及轉(zhuǎn)染條件，顯著提升表達(dá)效率，為結(jié)核病診斷及疫苗研發(fā)提供可靠技術(shù)方案。

引言

結(jié)核病（Tuberculosis, TB）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）引起的全球性傳染病，早期診斷和疫苗研發(fā)亟需高純度抗原支持。MPT64是結(jié)核菌分泌的關(guān)鍵免疫原性蛋白，其真核表達(dá)可保留天然構(gòu)象及翻譯后修飾，提升抗體結(jié)合效率。傳統(tǒng)原核表達(dá)系統(tǒng)因缺乏糖基化修飾，易導(dǎo)致抗原表位丟失。本研究通過真核載體構(gòu)建與表達(dá)優(yōu)化，結(jié)合威尼德電穿孔技術(shù)，實(shí)現(xiàn)MPT64的高效分泌表達(dá)，為免疫檢測(cè)及亞單位疫苗開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

實(shí)驗(yàn)部分

1. MPT64基因克隆與載體構(gòu)建

1.1 基因擴(kuò)增與引物設(shè)計(jì)

從結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組中擴(kuò)增MPT64基因（Rv1980c，全長(zhǎng)582 bp）。設(shè)計(jì)特異性引物：

正向引物：5'-CGGGATCCATGCAGACCGACGAACGC-3'（含BamHI酶切位點(diǎn)）

反向引物：5'-CCGCTCGAGTTAGGCGTTGATGTCCAG-3'（含XhoI酶切位點(diǎn)）

使用某試劑高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；30個(gè)循環(huán)（95℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 45 s）；72℃延伸10 min。

1.2 載體酶切與連接

將PCR產(chǎn)物與pCDNA3.1(+)載體分別用BamHI/XhoI雙酶切（某試劑限制性內(nèi)切酶），37℃孵育3 h。純化后通過T4 DNA連接酶（某試劑）16℃連接12 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布Amp+ LB平板，37℃培養(yǎng)16 h。

1.3 陽(yáng)性克隆篩選

挑取單菌落擴(kuò)增后，使用威尼德分子雜交儀進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，陽(yáng)性克隆送測(cè)序（某試劑測(cè)序服務(wù)），比對(duì)結(jié)果確認(rèn)無突變。

2. 真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染與表達(dá)

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

HEK293T細(xì)胞接種于6孔板（密度1×10^6/孔），使用DMEM+10% FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)至80%匯合。取4 μg重組質(zhì)粒pCDNA3.1-MPT64與2 μg pEGFP-N1（共轉(zhuǎn)染對(duì)照），采用威尼德電穿孔儀進(jìn)行轉(zhuǎn)染（參數(shù)：電壓250 V，電容950 μF，脈沖時(shí)間25 ms）。轉(zhuǎn)染后6 h更換培養(yǎng)基，48 h收集上清及細(xì)胞裂解液。

2.2 蛋白表達(dá)檢測(cè)

Western blot：細(xì)胞裂解液經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，依次加入抗MPT64單抗（某試劑，1:1000）和HRP標(biāo)記二抗（某試劑，1:5000），威尼德紫外交聯(lián)儀激活ECL底物顯影。

ELISA定量：包被抗MPT64多抗（1 μg/mL），加入細(xì)胞上清，TMB顯色后450 nm檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度。

3. 表達(dá)條件優(yōu)化

3.1 質(zhì)粒濃度梯度實(shí)驗(yàn)

比較1 μg、2 μg、4 μg質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量對(duì)表達(dá)效率的影響，結(jié)果顯示4 μg時(shí)蛋白產(chǎn)量最高（2.8 μg/mL），且細(xì)胞存活率＞85%。

3.2 轉(zhuǎn)染時(shí)間窗口優(yōu)化

在轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h分別收集樣本，48 h時(shí)分泌蛋白達(dá)峰值，72 h后因細(xì)胞凋亡導(dǎo)致產(chǎn)量下降。

結(jié)果與分析

載體構(gòu)建成功：酶切鑒定顯示BamHI/XhoI雙切后釋放582 bp片段，測(cè)序結(jié)果與GenBank（NC_000962.3）一致。

高效表達(dá)驗(yàn)證：Western blot在28 kDa處可見清晰條帶，與理論分子量相符；ELISA顯示分泌型MPT64濃度達(dá)2.8±0.3 μg/mL。

轉(zhuǎn)染效率提升：威尼德電穿孔儀使轉(zhuǎn)染效率達(dá)75%，較傳統(tǒng)脂質(zhì)體法（45%）顯著提高。

技術(shù)應(yīng)用優(yōu)勢(shì)

成本優(yōu)勢(shì)：真核表達(dá)系統(tǒng)無需純化復(fù)性步驟，某試劑高保真酶減少重復(fù)實(shí)驗(yàn)損耗，綜合成本降低30%。

靈敏度提升：分泌表達(dá)MPT64可直接用于ELISA，檢測(cè)限低至0.1 ng/mL，較原核表達(dá)蛋白提高10倍。

操作便捷性：威尼德原位雜交儀整合溫控與振蕩功能，單次可并行處理24樣本，耗時(shí)縮短40%。

結(jié)論

研究成功構(gòu)建MPT64真核表達(dá)載體，通過威尼德電穿孔技術(shù)實(shí)現(xiàn)高效分泌表達(dá)，為結(jié)核病診斷試劑盒開發(fā)及疫苗研究提供穩(wěn)定抗原來源。實(shí)驗(yàn)方案兼顧成本控制與靈敏度優(yōu)化，可快速適配規(guī)模化生產(chǎn)需求。

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