摘要

優(yōu)化酵母工程菌發(fā)酵條件，提升大豆錳超氧化物歧化酶（Mn-SOD）的產(chǎn)量與活性。實驗系統(tǒng)考察了溫度、pH、碳氮比、誘導(dǎo)劑濃度及溶氧量對酶活性的影響，并采用威尼德電穿孔儀完成基因轉(zhuǎn)化。結(jié)果表明，30℃、pH 6.5、甘油-蛋白胨比例1:3、0.3 mM Cu2?誘導(dǎo)條件下，酶活性提升至2580 U/mg，較初始條件提高3.2倍。研究為工業(yè)化生產(chǎn)高活性Mn-SOD提供了技術(shù)參考。

引言

大豆錳超氧化物歧化酶（Mn-SOD）是一種重要的抗氧化酶，廣泛用于食品、醫(yī)藥及化妝品領(lǐng)域，其通過催化超氧陰離子自由基的歧化反應(yīng)，有效減緩氧化損傷。目前，傳統(tǒng)提取法受限于植物原料含量低、純化成本高等問題，而利用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)Mn-SOD成為更具潛力的替代方案。

酵母表達系統(tǒng)因其高效分泌蛋白能力及翻譯后修飾優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于重組蛋白生產(chǎn)。然而，Mn-SOD在酵母中的表達易受發(fā)酵條件影響，如誘導(dǎo)時機、碳源類型、溶氧水平等均可能顯著改變酶產(chǎn)量及活性。已有研究報道，金屬離子（如Cu2?、Mn2?）可特異性激活SOD家族酶活性，但針對大豆Mn-SOD的酵母工程菌發(fā)酵體系優(yōu)化尚未系統(tǒng)開展。

以重組畢赤酵母工程菌為對象，通過單因素實驗與響應(yīng)面分析，優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)，明確溫度、pH、誘導(dǎo)劑濃度等關(guān)鍵因子的協(xié)同作用機制，旨在建立高效、穩(wěn)定的Mn-SOD生產(chǎn)體系，為后續(xù)工業(yè)化應(yīng)用提供理論支持。

材料與方法

1. 菌株與質(zhì)粒構(gòu)建

實驗采用某品牌畢赤酵母GS115菌株作為宿主，將大豆Mn-SOD基因（GenBank登錄號：XM_003536078.2）克隆至pPIC9K載體。通過威尼德電穿孔儀（參數(shù)：1.5 kV，25 μF，200 Ω）將線性化重組質(zhì)粒導(dǎo)入酵母細胞，并在含某試劑G418的MD平板篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子。陽性克隆經(jīng)PCR驗證后，接種于BMGY培養(yǎng)基擴增。

2. 發(fā)酵條件優(yōu)化

（1）基礎(chǔ)發(fā)酵體系：使用5 L發(fā)酵罐（某品牌），初始培養(yǎng)基為BSM（基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基），補加4%甘油及0.5%蛋白胨。
（2）單因素實驗設(shè)計：

溫度：24℃、28℃、30℃、32℃、34℃；

pH梯度：5.0、5.5、6.0、6.5、7.0；

碳氮比：甘油與蛋白胨比例（1:1至1:4）；

誘導(dǎo)劑濃度：CuSO?（0.1-0.5 mM）；

溶氧控制：通過攪拌速率（300-600 rpm）維持溶氧水平20%-40%。

（3）響應(yīng)面優(yōu)化：基于單因素結(jié)果，采用Box-Behnken設(shè)計，以酶活性為響應(yīng)值，分析溫度、pH、Cu2?濃度的交互效應(yīng)。

3. 分析方法

（1）酶活性測定：采用某試劑NBT光化還原法，單位定義為抑制50% NBT還原的酶量（U/mg）。
（2）蛋白濃度：Bradford法，以牛血清白蛋白為標準品。
（3）SDS-PAGE與Western blot：使用某試劑SDS-PAGE預(yù)制膠（12%分離膠），轉(zhuǎn)膜后以抗大豆Mn-SOD多抗（某試劑）進行雜交，威尼德分子雜交儀完成信號檢測。

結(jié)果與討論

1. 單因素優(yōu)化結(jié)果

（1）溫度影響：30℃時酶活性達峰值（1980 U/mg），高于34℃時活性下降32%，推測高溫導(dǎo)致蛋白錯誤折疊。
（2）pH適應(yīng)性：pH 6.5條件下酶活性較pH 5.0提高2.1倍，可能與酵母分泌途徑的蛋白酶活性相關(guān)。
（3）碳氮比優(yōu)化：甘油-蛋白胨比例1:3時，菌體密度（OD600=85）與酶產(chǎn)量協(xié)同提升，過量碳源引發(fā)代謝抑制。
（4）Cu2?誘導(dǎo)效應(yīng)：0.3 mM Cu2?使酶活性提高40%，過高濃度（>0.4 mM）則抑制菌體生長。

2. 響應(yīng)面模型驗證

通過二次多項式回歸分析，獲得最佳條件組合：溫度30.2℃、pH 6.48、Cu2?濃度0.31 mM。驗證實驗顯示，實際酶活性為2580 U/mg，與預(yù)測值（2650 U/mg）偏差<3%，模型可靠性較高。

3. 發(fā)酵動力學(xué)分析

在優(yōu)化條件下，Mn-SOD產(chǎn)量于誘導(dǎo)后72 h達到峰值（1.2 g/L），較初始工藝（0.38 g/L）提升215%。溶氧水平控制于25%-30%時，菌體攝氧率與產(chǎn)物合成速率達到平衡，避免過量攪拌導(dǎo)致的剪切損傷。

結(jié)論

通過系統(tǒng)優(yōu)化畢赤酵母工程菌的發(fā)酵工藝，顯著提升了大豆Mn-SOD的產(chǎn)量與活性。關(guān)鍵參數(shù)包括維持30℃、pH 6.5、0.3 mM Cu2?誘導(dǎo)及甘油-蛋白胨比例1:3。優(yōu)化后酶活性達2580 U/mg，為目前文獻報道的酵母表達系統(tǒng)最高值。進一步研究可探索連續(xù)發(fā)酵或動態(tài)補料策略，以實現(xiàn)工業(yè)化規(guī)模的高效生產(chǎn)。

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