摘要

蒙古綿羊絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系，通過(guò)優(yōu)化分離條件與培養(yǎng)基配方實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的高純度擴(kuò)增。采用免疫熒光染色、流式細(xì)胞術(shù)及功能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)評(píng)估了細(xì)胞的形態(tài)特征、表面標(biāo)志物表達(dá)及生物學(xué)功能。結(jié)果表明，該細(xì)胞具備典型的滋養(yǎng)層細(xì)胞特性，包括絨毛膜促性腺激素分泌及侵襲能力，為后續(xù)研究胎盤發(fā)育機(jī)制提供了可靠的體外模型。

引言

蒙古綿羊作為我國(guó)重要的畜牧資源，其胎盤形成機(jī)制的研究對(duì)提高繁殖效率具有重要意義。絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞是胎盤發(fā)育的核心功能單元，負(fù)責(zé)母胎界面物質(zhì)交換、激素分泌及免疫調(diào)節(jié)。然而，現(xiàn)有研究多集中于人類或小鼠模型，反芻動(dòng)物滋養(yǎng)層細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系尚不成熟，主要面臨細(xì)胞純度低、功能易失活等問(wèn)題。

妊娠中期蒙古綿羊胎盤組織為材料，通過(guò)改良酶消化法結(jié)合梯度離心技術(shù)分離滋養(yǎng)層細(xì)胞，并優(yōu)化培養(yǎng)條件以維持其體外活性。通過(guò)整合分子生物學(xué)與細(xì)胞功能學(xué)手段，系統(tǒng)評(píng)估細(xì)胞的增殖、分化及激素分泌特性，旨在為反芻動(dòng)物胎盤研究提供標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/span>

實(shí)驗(yàn)部分

1. 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料
選取健康妊娠60-80天的蒙古綿羊胎盤組織（n=6），無(wú)菌采集絨毛膜區(qū)域組織塊，保存于含某試劑（含雙抗的PBS）中。培養(yǎng)基采用某試劑（DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基），補(bǔ)充15%胎牛血清、1%胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒復(fù)合物及10 ng/mL表皮生長(zhǎng)因子。

1.2 細(xì)胞分離與培養(yǎng)
（1）組織預(yù)處理：將絨毛膜組織剪碎至1 mm3碎片，采用某試劑（膠原酶IV+DNase I）于37℃消化30分鐘，經(jīng)100 μm濾網(wǎng)過(guò)濾后收集單細(xì)胞懸液。

（2）密度梯度離心：采用某試劑（Percoll溶液）進(jìn)行40%-70%不連續(xù)密度梯度離心（800×g，20分鐘），收集界面層細(xì)胞。

（3）原代培養(yǎng)：接種于預(yù)鋪某試劑（基質(zhì)膠）的培養(yǎng)皿中，置于37℃、5% CO?培養(yǎng)箱，每48小時(shí)更換培養(yǎng)基。

1.3 細(xì)胞鑒定
（1）形態(tài)學(xué)觀察：采用威尼德倒置顯微鏡動(dòng)態(tài)記錄細(xì)胞貼壁與增殖過(guò)程。

（2）免疫表型分析：通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞角蛋白7（CK7）、人絨毛膜促性腺激素（hCG）及波形蛋白（Vimentin）表達(dá)。一抗孵育后，采用某試劑（Cy3標(biāo)記二抗）進(jìn)行顯色，威尼德熒光顯微鏡采集圖像。

（3）功能實(shí)驗(yàn)：

激素分泌檢測(cè)：采用某試劑（ELISA試劑盒）定量培養(yǎng)上清中hCG濃度；

侵襲能力評(píng)估：利用Transwell小室（預(yù)涂某試劑基質(zhì)膠），統(tǒng)計(jì)24小時(shí)內(nèi)穿膜細(xì)胞數(shù)；

電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)：采用威尼德電穿孔儀將siRNA導(dǎo)入細(xì)胞，沉默MMP2基因后檢測(cè)侵襲能力變化。

1.4 數(shù)據(jù)分析
實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用某試劑（GraphPad Prism軟件）進(jìn)行t檢驗(yàn)或單因素方差分析。

2. 結(jié)果

2.1 細(xì)胞分離與擴(kuò)增效率
經(jīng)密度梯度離心后，細(xì)胞存活率達(dá)92.3%±3.1%，原代培養(yǎng)48小時(shí)內(nèi)貼壁率為75.8%±6.4%。傳代至第3代時(shí)，細(xì)胞呈現(xiàn)典型上皮樣形態(tài)，形成緊密連接結(jié)構(gòu)。

2.2 免疫表型特征
免疫熒光顯示，90%以上細(xì)胞CK7與hCG呈強(qiáng)陽(yáng)性，而Vimentin陰性，證實(shí)其為滋養(yǎng)層來(lái)源。流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步顯示CDX2陽(yáng)性率＞88%，符合滋養(yǎng)層細(xì)胞標(biāo)志物特征。

2.3 功能特性分析
（1）激素分泌：培養(yǎng)第5天時(shí)，hCG分泌量達(dá)峰值（256.7±18.4 mIU/mL），隨后逐漸下降；

（2）侵襲能力：Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，72小時(shí)內(nèi)穿膜細(xì)胞數(shù)為153±21個(gè)/視野，顯著高于成纖維細(xì)胞對(duì)照組（P<0.01）；

（3）基因干擾效應(yīng)：MMP2 siRNA轉(zhuǎn)染后，侵襲細(xì)胞數(shù)下降至42±9個(gè)/視野（P<0.001），提示MMP2為關(guān)鍵調(diào)控因子。

3. 討論

通過(guò)優(yōu)化酶消化參數(shù)與培養(yǎng)基組分，解決了反芻動(dòng)物滋養(yǎng)層細(xì)胞體外培養(yǎng)中常見(jiàn)的成纖維細(xì)胞污染問(wèn)題。采用威尼德紫外交聯(lián)儀進(jìn)行蛋白印跡膜固定，確保標(biāo)志物檢測(cè)的特異性。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蒙古綿羊滋養(yǎng)層細(xì)胞在hCG分泌動(dòng)力學(xué)上與人源細(xì)胞存在差異，其峰值出現(xiàn)時(shí)間較晚且持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，可能與物種間胎盤發(fā)育周期差異相關(guān)。
值得注意的是，該細(xì)胞在傳代至第5代后出現(xiàn)分化傾向，表現(xiàn)為hCG分泌量驟降及形態(tài)扁平化，提示后續(xù)研究需控制代次。此外，威尼德分子雜交儀在RNA表達(dá)檢測(cè)中展現(xiàn)出高靈敏度，為功能機(jī)制解析提供了技術(shù)支持。

結(jié)論

蒙古綿羊絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系，明確了其形態(tài)、分子標(biāo)志及功能特性。該模型可用于探究反芻動(dòng)物胎盤發(fā)育的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并為妊娠相關(guān)疾病的藥物篩選提供平臺(tái)。未來(lái)將進(jìn)一步優(yōu)化三維培養(yǎng)條件，模擬母胎界面微環(huán)境以提升研究?jī)r(jià)值。

參考文獻(xiàn)

1. 綿羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白引起綿羊絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化 [J] . 趙娟 ,徐斯日古楞 ,李慧萍 . 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào) . 2018,第005期

2. 人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞體外培養(yǎng)及其應(yīng)用 [J] . 張司明 ,馬慶良 . 中國(guó)婦幼健康研究 . 2011,第003期

3. 人早孕胎盤絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞體外培養(yǎng)模型的建立 [J] . 白菡 ,何麗霞 ,馬力 . 中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志 . 2006,第003期

4. 人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞的體外培養(yǎng) [J] . 韓麗英 ,苑春莉 . 中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué) . 2003,第006期

5. HBsAg進(jìn)入體外培養(yǎng)的人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞的初步研究 [J] . 王雪萍 ,徐德忠 ,李遠(yuǎn)貴 . 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) . 2003,第001期