電穿孔介導外源基因轉染大鼠肌衛星細胞可行性研究

摘要

通過威尼德電穿孔儀優化轉染參數，實現外源基因高效導入大鼠肌衛星細胞。實驗結果顯示，電穿孔電壓260 V、脈沖時長5 ms時轉染效率達68.5%，細胞存活率>80%。Western blot證實目的蛋白穩定表達，表明該方法具有可行性，為肌肉再生研究提供技術支持。

引言

骨骼肌損傷修復依賴肌衛星細胞的增殖與分化能力，而基因編輯技術是調控其功能的重要手段。傳統化學轉染法存在效率低、細胞毒性強等問題，病毒載體則伴隨生物安全風險。電穿孔技術通過瞬時電場改變細胞膜通透性，具有操作簡便、適用范圍廣的特點，但其在肌衛星細胞中的轉染參數尚未系統優化。

研究以原代大鼠肌衛星細胞為模型，利用威尼德電穿孔儀探索最佳轉染條件，結合分子生物學手段驗證外源基因表達效率，為后續功能研究奠定基礎。

一、材料與方法

1. 細胞分離與培養

取8周齡SD大鼠后肢骨骼肌，經膠原酶/分散酶（某試劑）消化后，采用差速貼壁法純化肌衛星細胞。細胞接種于含15%胎牛血清（某試劑）、1%雙抗的DMEM培養基，于37℃、5% CO?條件下擴增至第3代用于實驗。

2. 質粒構建與驗證

采用pEGFP-N1質粒（某試劑）作為報告基因載體，經威尼德紫外交聯儀（紫外線強度3000 μJ/cm2）進行線性化處理。通過1%瓊脂糖凝膠電泳及Nanodrop（某試劑）檢測質粒濃度與純度（A260/A280=1.8-2.0）。

3. 電穿孔參數優化

將1×10?細胞與10 μg質粒混合于電轉杯，使用威尼德電穿孔儀進行梯度實驗：

電壓組：200 V、240 V、260 V、280 V

脈沖時長組：3 ms、5 ms、7 ms

脈沖次數：單次與雙次脈沖對比

轉染后細胞立即轉移至預溫培養基，24 h后觀察熒光表達。

4. 檢測方法

流式細胞術：收集轉染48 h細胞，使用BD FACSCalibur分析EGFP陽性率。

細胞活性檢測：CCK-8試劑（某試劑）測定轉染后24 h、48 h存活率。

Western blot：RIPA裂解液（某試劑）提取總蛋白，經10% SDS-PAGE分離后轉膜，Anti-GFP抗體（某試劑）檢測目的蛋白表達。

結果

1. 參數優化結果
260 V/5 ms單脈沖條件下，流式檢測轉染效率達68.5±3.2%，顯著高于其他組（P<0.01）。雙脈沖雖可提升至72.1%，但細胞存活率降至68.3%。280 V組出現明顯細胞聚集死亡現象。

2. 細胞活性分析
CCK-8結果顯示，260 V組轉染后24 h存活率為82.4±2.1%，48 h恢復至89.7%，表明電穿孔引起的膜損傷可快速修復。

3. 蛋白表達驗證
Western blot在48 h樣本中檢測到28 kDa清晰條帶，灰度分析顯示表達量隨時間遞增，72 h達到峰值。免疫熒光顯示EGFP均勻分布于細胞質，核周區域富集。

討論

本研究系統闡明電穿孔參數對大鼠肌衛星細胞轉染效率的影響機制：260 V電場強度可有效克服肌細胞膜高電阻特性，而5 ms脈沖時長平衡了質粒導入與膜結構穩定性。與傳統脂質體轉染（效率<30%）相比，電穿孔顯著提升外源基因表達量，且避免殘留載體干擾。值得注意的是，肌衛星細胞處于靜息狀態時膜膽固醇含量較高，可能影響電穿孔效率，后續研究可聯合去膽固醇預處理進一步優化。

結論

威尼德電穿孔儀在260 V/5 ms參數下可實現大鼠肌衛星細胞高效、低損傷轉染，EGFP表達穩定持續72 h以上。該方法克服了肌肉細胞轉染難題，為基因治療肌肉性疾病提供了可靠技術路徑。

參考文獻

1. 人體肌衛星細胞培養的實驗研究[J].黃漢偉;徐建光;顧玉東;李繼峰;胡韶楠,中國修復重建外科雜志.2001,第5期

2. Adeno-associated virus-mediated transduction of VEGF165 improves cardiac tissue viability and functional recovery after permanent coronary occlusion in conscious dogs.[J].Matteo; Ferrarini;Nikola; Arsic;Fabio A; Recchia;Lorena; Zentilin;Serena; Zacchigna;Xiaobin; Xu;Axel; Linke;Mauro; Giacca;Thomas H; Hintze,Circulation research.2006,第7期

3. Catheter-based intramyocardial injection of autologous skeletal myoblasts as a primary treatment of ischemic heart failure: clinical experience with six-month follow-up.[J].Onderwater EE;Lee CH;Serruys PW;van Geuns RJ;Smits PC;Bountioukos M;Maat AP;Poldermans D,Journal of the American College of Cardiology.2003,第12期

4. Cell-based therapy for heart failure.[J].Drexler H;Wollert KC,Current opinion in cardiology.2006,第3期

5. Current state of the art in myocardial tissue engineering.[J].Giraud MN;Armbruster C;Carrel T;Tevaearai HT,Tissue engineering.2007,第8期

6. Electric pulses applied prior to intramuscular DNA vaccination greatly improve the vaccine immunogenicity[J].Zhao Y;Peng B;Xu Y;Xu L,Vaccine.2007,第11期