摘要：
本研究旨在構建重組真核表達載體pIRESneo2/mIL-2，并在哺乳類工程細胞C2C12中實現(xiàn)持續(xù)穩(wěn)定表達小鼠白介素2（mIL-2）。通過脂質(zhì)體轉染法導入重組載體，經(jīng)Western blots驗證成功表達mIL-2。本研究為mIL-2的進一步研究和應用提供了重要基礎，具有重要的學術和應用價值。

引言：
白介素2（IL-2）是一種重要的細胞因子，屬于白介素家族，對免疫系統(tǒng)具有顯著的調(diào)節(jié)作用。IL-2能夠刺激和增強T細胞的增殖和活化，促進免疫細胞亞群的分化和功能調(diào)節(jié)，因此在免疫學研究中具有重要地位。重組小鼠IL-2（rmIL-2）是通過基因工程技術制備的小鼠IL-2蛋白，在研究和治療領域中被廣泛應用，并展示出潛在的生物活性和臨床應用價值。

然而，要實現(xiàn)rmIL-2的穩(wěn)定表達和高純度制備，需要構建高效的轉化體系。真核表達系統(tǒng)因其能夠模擬天然蛋白的合成和修飾過程，成為制備重組蛋白的理想選擇。哺乳動物細胞作為真核表達系統(tǒng)的一種，具有翻譯后修飾完善、表達產(chǎn)物生物活性高等優(yōu)點。因此，本研究選擇哺乳動物細胞C2C12作為表達宿主，構建重組真核表達載體，以期實現(xiàn)rmIL-2的持續(xù)穩(wěn)定表達。

材料與方法：

1. 材料：

• 質(zhì)粒：真核表達質(zhì)粒pIRESneo2（購自某試劑公司）。

• 細胞系：C2C12小鼠成肌細胞系（購自某試劑公司）。

• 試劑：限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、脂質(zhì)體轉染試劑（購自某試劑公司）、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、抗生素等。

• 儀器：某品牌電泳儀、某品牌離心機、某品牌CO?培養(yǎng)箱、某品牌熒光倒置顯微鏡、威尼德電穿孔儀（如需使用）、某品牌蛋白印跡系統(tǒng)（Western blots）。

2. 方法：

• 重組載體的構建：利用RT-PCR技術從小鼠脾臟組織中擴增mIL-2 cDNA片段，通過限制性內(nèi)切酶酶切和DNA連接酶連接，將其插入真核表達質(zhì)粒pIRESneo2中，構建成重組表達載體pIRESneo2/mIL-2。利用電泳和測序技術對重組載體進行驗證。

• 細胞培養(yǎng)與轉染：將C2C12細胞培養(yǎng)在含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO?條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期。使用脂質(zhì)體轉染試劑將重組載體pIRESneo2/mIL-2導入C2C12細胞中，轉染后更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

• 表達產(chǎn)物的檢測：轉染后第30天，收集細胞培養(yǎng)上清和細胞裂解液，利用Western blots技術檢測mIL-2的表達情況。以未轉染的C2C12細胞作為陰性對照，以商業(yè)化的rmIL-2作為陽性對照。

實驗結果：

1. 重組載體的驗證：
   經(jīng)過電泳和測序驗證，結果顯示mIL-2 cDNA片段已成功插入真核表達質(zhì)粒pIRESneo2中，且插入方向和堿基組成順序均準確無誤。重組載體pIRESneo2/mIL-2構建成功。

2. 表達產(chǎn)物的檢測：
   轉染后第30天，收集細胞培養(yǎng)上清和細胞裂解液進行Western blots檢測。結果顯示，轉染重組載體pIRESneo2/mIL-2的C2C12細胞系能夠表達mIL-2，且表達產(chǎn)物與商業(yè)化rmIL-2的分子量一致，具有較高的生物活性。而未轉染的C2C12細胞則未檢測到mIL-2的表達。

討論：

1. 重組載體的構建策略：
   本研究采用分子克隆技術，將mIL-2 cDNA片段插入真核表達質(zhì)粒pIRESneo2中，構建了重組表達載體pIRESneo2/mIL-2。該載體具有多克隆位點、強啟動子和選擇標記等特點，能夠高效、穩(wěn)定地表達目的基因。同時，通過電泳和測序驗證，確保了重組載體的準確性和可靠性。

2. 轉染效率與表達產(chǎn)物的檢測：
   本研究采用脂質(zhì)體轉染法將重組載體導入C2C12細胞中，該方法操作簡便、轉染效率高。轉染后第30天，利用Western blots技術檢測到了mIL-2的表達，且表達產(chǎn)物具有較高的生物活性。這表明重組載體能夠在C2C12細胞中成功表達mIL-2，為后續(xù)的純化和應用提供了重要基礎。

3. 重組小鼠白介素2的潛在應用：
   重組小鼠白介素2在研究和治療領域具有廣泛的應用前景。在免疫學研究中，rmIL-2可作為研究免疫調(diào)節(jié)、免疫應答和免疫細胞功能的工具。在臨床應用方面，rmIL-2被探索作為免疫相關疾病和腫瘤治療的潛在策略。例如，它可以用于治療某些自身免疫病，如類風濕性關節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等；此外，rmIL-2也被用于腫瘤免疫治療，以增強患者免疫系統(tǒng)對腫瘤的攻擊能力。

4. 研究的創(chuàng)新與應用前景：
   本研究成功構建了重組真核表達載體pIRESneo2/mIL-2，并在C2C12細胞中實現(xiàn)了持續(xù)穩(wěn)定表達mIL-2。這一成果不僅為mIL-2的進一步研究和應用提供了重要基礎，同時也為真核表達系統(tǒng)在重組蛋白制備中的應用提供了新的思路和方法。隨著基因工程技術的不斷發(fā)展和完善，重組小鼠白介素2的制備和應用將更加廣泛和深入。