高通量小間距細(xì)胞電穿孔裝置設(shè)計(jì)測(cè)試

摘要：本文介紹了一種新型的高通量小間距細(xì)胞電穿孔裝置，采用電絕緣的聚氯乙烯（PVC）薄膜制作，電極間距為80μm。該裝置不僅顯著降低了細(xì)胞電穿孔所需的電壓，提高了實(shí)驗(yàn)操作的安全性，還實(shí)現(xiàn)了高通量操作，提升了實(shí)驗(yàn)效率。盡管電穿孔轉(zhuǎn)化效率有所降低，但通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)參數(shù)，該裝置在基因工程領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

引言

細(xì)胞電穿孔技術(shù)，又稱電轉(zhuǎn)染技術(shù)，是一種常用的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法。該技術(shù)通過(guò)施加一定的電場(chǎng)強(qiáng)度可逆地?fù)舸┘?xì)胞膜，在細(xì)胞膜上形成小孔或通路，從而將遺傳物質(zhì)引入細(xì)胞內(nèi)。自1982年由Neumann等報(bào)道以來(lái)，電穿孔技術(shù)已成為基因工程領(lǐng)域和新興的合成生物學(xué)領(lǐng)域的重要環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的細(xì)胞電穿孔裝置通常需要幾百伏到幾千伏的電壓，操作危險(xiǎn)且依賴人工，難以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化運(yùn)行。

為解決傳統(tǒng)電穿孔儀的局限，微型電穿孔技術(shù)在2000年被提出。微型電穿孔儀雖然提高了細(xì)胞存活率和細(xì)胞轉(zhuǎn)染率，甚至實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè)細(xì)胞的電穿孔操作，但處理的細(xì)胞數(shù)量偏少，難以滿足生物學(xué)實(shí)際應(yīng)用中對(duì)細(xì)胞數(shù)量的需求。為此，本研究設(shè)計(jì)了一種高通量小間距細(xì)胞電穿孔裝置，旨在降低細(xì)胞電穿孔所需電壓，提高細(xì)胞處理量，并實(shí)現(xiàn)高通量操作。

材料與方法

1. 裝置設(shè)計(jì)與制作

本研究采用電絕緣的聚氯乙烯（PVC）薄膜制作了一種電極間距為80μm的小間距電穿孔裝置。PVC薄膜的厚度決定了電極間距，本實(shí)驗(yàn)采用厚度為0.08mm（80μm）的PVC薄膜。裝置的出入口可以通過(guò)硅膠軟管與蠕動(dòng)泵或注射器相連，實(shí)現(xiàn)高通量操作。

2. 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

• 菌株：大腸桿菌MG1655（購(gòu)自某公司）和畢次酵母GS115（購(gòu)自某公司）。

• 質(zhì)粒：pUC57（購(gòu)自某公司，質(zhì)粒濃度為122.127ng/μL）和pPIC9K（購(gòu)自某公司，質(zhì)粒濃度為224.600ng/μL）。

• 試劑：SOC緩沖液、LB（Luria-Bertani）瓊脂培養(yǎng)基、卡那霉素、MD（Minimal Dextrase）培養(yǎng)基、D-山梨醇溶液。

3. 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

• 某品牌電穿孔儀：威尼德電穿孔儀，用于提供脈沖電壓。

• 注射泵：用于控制細(xì)胞液的注入速度。

• 硅膠軟管：用于連接裝置的出入口與蠕動(dòng)泵或注射器。

4. 實(shí)驗(yàn)參數(shù)

• 脈沖電壓：通過(guò)威尼德電穿孔儀的XXX模式設(shè)定。

• 電穿孔腔體體積：2μL。

• 脈沖發(fā)生器：每5秒施加一次脈沖電壓。

• 注射泵速度：0.4μL/s。

5. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

• 大腸桿菌MG1655轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pUC57實(shí)驗(yàn)：

1. 往100μL的感受態(tài)細(xì)胞液內(nèi)加入1μL質(zhì)粒，混勻。

2. 通過(guò)注射泵以0.4μL/s的速度注入電穿孔裝置進(jìn)行電穿孔，電壓分別為200V、220V、240V、260V、280V和300V。

3. 電穿孔后，將細(xì)胞液與900μL SOC緩沖液混合，放入37℃搖床復(fù)蘇1小時(shí)。

4. 將細(xì)胞液涂布于含卡那霉素（終濃度為50mg/μL）的LB瓊脂培養(yǎng)基上，放入37℃溫箱過(guò)夜培養(yǎng)，第2天早上統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)。

• 畢次酵母GS115轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pPIC9K實(shí)驗(yàn)：

1. 往100μL的感受態(tài)細(xì)胞液內(nèi)加入1μL質(zhì)粒，混勻。

2. 通過(guò)注射泵以0.4μL/s的速度注入電穿孔裝置進(jìn)行電穿孔，電壓為150V。

3. 電穿孔后，將細(xì)胞液與900μL 1mol/L的D-山梨醇溶液混合，放入30℃搖床復(fù)蘇1小時(shí)。

4. 將細(xì)胞液涂布于MD培養(yǎng)基平板上，放入30℃溫箱中培養(yǎng)3天，第4天早上統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 大腸桿菌MG1655轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pUC57實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在6種測(cè)試電壓下（200V、220V、240V、260V、280V和300V），LB瓊脂板上均有菌落長(zhǎng)出，表明這些電壓條件下都有細(xì)胞成功電穿孔。然而，相比于采用1mm標(biāo)準(zhǔn)電擊杯（通常施加1.8kV脈沖電壓），該電穿孔裝置成功進(jìn)行電穿孔所需的電壓降低了一個(gè)數(shù)量級(jí)，但電穿孔轉(zhuǎn)化效率也降低了一個(gè)數(shù)量級(jí)。

2. 畢次酵母GS115轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pPIC9K實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組的MD平板上有菌落長(zhǎng)出，但菌落數(shù)量比對(duì)照組（采用1mm標(biāo)準(zhǔn)電擊杯，施加1.5kV脈沖電壓）低了一個(gè)數(shù)量級(jí)。這表明，相比于1mm標(biāo)準(zhǔn)電擊杯，該電穿孔裝置成功進(jìn)行電穿孔所需的電壓降低了一個(gè)數(shù)量級(jí)，但電穿孔轉(zhuǎn)化效率同樣降低了一個(gè)數(shù)量級(jí)。

討論

本研究設(shè)計(jì)的高通量小間距細(xì)胞電穿孔裝置顯著降低了細(xì)胞電穿孔所需的電壓，提高了實(shí)驗(yàn)操作的安全性。同時(shí)，通過(guò)硅膠軟管與蠕動(dòng)泵或注射器的連接，實(shí)現(xiàn)了高通量操作，提高了實(shí)驗(yàn)效率。然而，電穿孔轉(zhuǎn)化效率比1mm標(biāo)準(zhǔn)電擊杯低了一個(gè)數(shù)量級(jí)，這可能與以下因素有關(guān)：

1. 電穿孔腔橫截面的長(zhǎng)寬比：該裝置電穿孔腔橫截面的長(zhǎng)寬比（長(zhǎng)度2mm、寬度0.08mm）較大，導(dǎo)致更多細(xì)胞處于靠近電極的區(qū)域。而該區(qū)域在施加電壓過(guò)程中的溫度、pH變化較大，可能影響電穿孔效率。

2. 電壓波形與持續(xù)時(shí)間：針對(duì)該電穿孔裝置所采用的電壓波形、持續(xù)時(shí)間等參數(shù)可能不夠理想，需要進(jìn)一步優(yōu)化。

策略與創(chuàng)新

為提高電穿孔效率，可以從以下幾個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化：

1. PVC薄膜通道形狀：通過(guò)改變PVC薄膜通道的形狀，調(diào)整電穿孔腔橫截面的長(zhǎng)寬比，以減少溫度、pH變化對(duì)電穿孔效率的影響。

2. 電壓波形與持續(xù)時(shí)間：進(jìn)一步優(yōu)化電壓波形、大小及持續(xù)時(shí)間等參數(shù)，以提高電穿孔效率。

3. 自動(dòng)化與智能化：隨著科技的發(fā)展，可以設(shè)計(jì)智能電穿孔系統(tǒng)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞狀態(tài)和電場(chǎng)參數(shù)，自動(dòng)調(diào)整電穿孔條件，以實(shí)現(xiàn)最佳的實(shí)驗(yàn)效果。

應(yīng)用前景

盡管電穿孔轉(zhuǎn)化效率有所降低，但高通量小間距細(xì)胞電穿孔裝置在基因工程領(lǐng)域仍具有廣闊的應(yīng)用前景。特別是在需要高通量操作、細(xì)胞數(shù)量需求較大的實(shí)驗(yàn)中，該裝置能夠顯著提高實(shí)驗(yàn)效率，降低操作風(fēng)險(xiǎn)。此外，通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)參數(shù)，該裝置有望在未來(lái)實(shí)現(xiàn)更高的電穿孔效率，為基因治療、藥物研發(fā)等領(lǐng)域提供更加高效的工具。

結(jié)論

本研究設(shè)計(jì)了一種高通量小間距細(xì)胞電穿孔裝置，采用電絕緣的聚氯乙烯（PVC）薄膜制作，電極間距為80μm。該裝置顯著降低了細(xì)胞電穿孔所需的電壓，提高了實(shí)驗(yàn)操作的安全性，并實(shí)現(xiàn)了高通量操作。盡管電穿孔轉(zhuǎn)化效率有所降低，但通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)參數(shù)，該裝置在基因工程領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。未來(lái)，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，該裝置有望在細(xì)胞治療、基因治療、藥物研發(fā)等領(lǐng)域發(fā)揮更加重要的作用。