外源基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞技術(shù)作為現(xiàn)代生物學(xué)與醫(yī)學(xué)研究的關(guān)鍵工具，歷經(jīng)多年發(fā)展取得了豐碩成果。本綜述系統(tǒng)闡述了該技術(shù)的研究現(xiàn)狀，涵蓋物理、化學(xué)、生物三大類轉(zhuǎn)染方法，深入剖析各類方法的原理、優(yōu)勢(shì)與局限性；詳細(xì)探討轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞毒性、基因表達(dá)穩(wěn)定性等核心評(píng)價(jià)指標(biāo)；并聚焦新興技術(shù)如納米材料介導(dǎo)、CRISPR-Cas 系統(tǒng)輔助轉(zhuǎn)染的前沿進(jìn)展。旨在為科研人員精準(zhǔn)選擇適配的轉(zhuǎn)染策略、攻克現(xiàn)存技術(shù)瓶頸，及推動(dòng)跨學(xué)科研究應(yīng)用提供全面、前沿且具深度的專業(yè)參考。
在生命科學(xué)蓬勃發(fā)展的當(dāng)下，探究基因功能、構(gòu)建疾病模型、研發(fā)基因治療方案等諸多關(guān)鍵研究領(lǐng)域，均離不開(kāi)外源基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞技術(shù)。這一技術(shù)宛如一座橋梁，跨越了外源遺傳物質(zhì)與靶細(xì)胞之間的天然屏障，使得人為操控細(xì)胞基因表達(dá)成為可能，進(jìn)而解鎖眾多生命奧秘，為攻克疑難病癥開(kāi)辟嶄新路徑。
自上世紀(jì) 70 年代基因轉(zhuǎn)染技術(shù)雛形初現(xiàn)，歷經(jīng)數(shù)十年探索，科研人員從早期借助病毒天然感染機(jī)制，逐步拓展至融合物理學(xué)、化學(xué)多學(xué)科原理創(chuàng)新轉(zhuǎn)染手段，成果斐然卻也挑戰(zhàn)重重。當(dāng)下，如何在確保高效轉(zhuǎn)染的同時(shí)降低細(xì)胞毒性、精準(zhǔn)調(diào)控轉(zhuǎn)染后基因表達(dá)時(shí)空特性，依舊是亟待攻克的前沿課題。本文將全方面梳理外源基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展脈絡(luò)、詳述主流技術(shù)細(xì)節(jié)、剖析前沿突破，以期為學(xué)界同仁呈上一份詳實(shí)且具啟發(fā)性的技術(shù)指南。
電穿孔技術(shù)基于細(xì)胞膜在高強(qiáng)度電場(chǎng)作用下瞬間形成可逆性微孔這一更好電學(xué)特性。當(dāng)向細(xì)胞懸液施加特定脈沖電場(chǎng)，通常電場(chǎng)強(qiáng)度維持在 100 - 1000 V/cm、脈沖持續(xù)時(shí)間為微秒至毫秒級(jí)，細(xì)胞膜磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)紊亂，孔隙應(yīng)運(yùn)而生，外源 DNA、RNA 等遺傳物質(zhì)順勢(shì)經(jīng)孔隙擴(kuò)散入胞內(nèi)。
在實(shí)驗(yàn)操作層面，科研人員先將靶細(xì)胞輕柔重懸于預(yù)冷的電轉(zhuǎn)緩沖液，緩沖液成分經(jīng)精細(xì)調(diào)配以維持細(xì)胞滲透壓與離子穩(wěn)態(tài)；精準(zhǔn)調(diào)控細(xì)胞密度至適宜范圍，一般哺乳動(dòng)物細(xì)胞濃度為 1×10? - 1×10? 個(gè) /mL。隨后按一定比例混入待轉(zhuǎn)染核酸，轉(zhuǎn)移至特制電轉(zhuǎn)杯，安置于電穿孔儀電極間。依細(xì)胞類型差異微調(diào)電穿孔參數(shù)，例如轉(zhuǎn)染小鼠胚胎干細(xì)胞，電場(chǎng)強(qiáng)度設(shè)為 800 V/cm、脈沖時(shí)長(zhǎng) 30 ms，重復(fù)電擊 2 - 3 次，確保核酸足量攝入細(xì)胞，操作全程嚴(yán)格把控溫度、避免氣泡生成，以防細(xì)胞受損。
顯微注射堪稱細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染領(lǐng)域的 “精密外科手術(shù)"。在高倍倒置顯微鏡輔助下，借助纖細(xì)玻璃微針（直徑常小于 1 μm），研究人員手動(dòng)將外源基因溶液精準(zhǔn)注入單個(gè)細(xì)胞胞質(zhì)或細(xì)胞核。這一技術(shù)優(yōu)勢(shì)顯著，轉(zhuǎn)染物質(zhì)劑量精準(zhǔn)可控，近乎無(wú)核酸降解風(fēng)險(xiǎn)，基因遞送效率出眾；然而技術(shù)門檻頗高，對(duì)操作人員熟練度、儀器精密度要求苛刻，通量極低，僅適用于少量珍貴細(xì)胞樣本，如胚胎干細(xì)胞早期發(fā)育研究、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型構(gòu)建初期細(xì)胞操作。
實(shí)際操作時(shí)，需先運(yùn)用拉針儀精心制備微針，經(jīng)煅燒、打磨確保針尖順滑銳利；固定細(xì)胞于顯微操作臺(tái)上，借助負(fù)壓輕柔吸附細(xì)胞，操控微針緩慢刺入預(yù)定細(xì)胞區(qū)室，以皮升級(jí)微量注射器精準(zhǔn)推送核酸溶液，注射體積常嚴(yán)控在 1 - 10 pL，過(guò)程需全程監(jiān)測(cè)細(xì)胞形態(tài)，損傷引發(fā)細(xì)胞裂解。
脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染是實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用最為廣泛的化學(xué)轉(zhuǎn)染手段之一，核心原理是陽(yáng)離子脂質(zhì)體與帶負(fù)電核酸分子借靜電引力自發(fā)組裝成復(fù)合物。陽(yáng)離子脂質(zhì)頭部親和核酸磷酸基團(tuán)，疏水尾部相互靠攏，包裹核酸形成納米級(jí)脂質(zhì)微粒；該微粒憑借脂質(zhì)成分與細(xì)胞膜脂質(zhì)相似相溶特性，融合細(xì)胞膜，將核酸釋放至胞內(nèi)。
實(shí)驗(yàn)流程起始于脂質(zhì)體與核酸按特定質(zhì)量比（依細(xì)胞、核酸種類微調(diào)，常見(jiàn) 1:1 - 3:1）室溫孵育 15 - 30 分鐘，促使復(fù)合物穩(wěn)定成型；轉(zhuǎn)染前細(xì)胞換用無(wú)血清培養(yǎng)基，旨在降低血清蛋白對(duì)外源復(fù)合物干擾；輕柔滴加復(fù)合物至細(xì)胞培養(yǎng)皿，置于 37°C、5% CO?孵箱孵育 2 - 6 小時(shí)后，補(bǔ)加含血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。以人腎上皮細(xì)胞 HEK293T 轉(zhuǎn)染熒光報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)為例，脂質(zhì)體 2000 與質(zhì)粒 DNA 按 2:1 配比，轉(zhuǎn)染 4 小時(shí)后熒光顯微鏡下可見(jiàn)顯著綠色熒光蛋白表達(dá)，轉(zhuǎn)染效率超 50%，但部分細(xì)胞因脂質(zhì)累積現(xiàn)輕微毒性表征。
磷酸鈣共沉淀法巧妙利用了磷酸鈣在生理?xiàng)l件下形成沉淀裹挾核酸沉淀至細(xì)胞表面，借細(xì)胞內(nèi)吞機(jī)制攝取外源基因。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將氯化鈣溶液與含核酸磷酸緩沖液緩慢混合，在特定 pH（約 7.0 - 7.4）、溫度（室溫至 37°C）條件下孵育，促使細(xì)微磷酸鈣 - 核酸共沉淀析出；均勻滴加至細(xì)胞層，孵育數(shù)小時(shí)后細(xì)胞經(jīng)內(nèi)吞攝取沉淀微粒實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染。
如在小鼠成纖維細(xì)胞 NIH3T3 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，先配置 25 mM 氯化鈣、2X HBS（ Hepes 緩沖鹽水），將 1 - 10 μg 質(zhì)粒 DNA 混入氯化鈣溶液，逐滴加至等體積 2X HBS，渦旋混勻、室溫靜置 30 分鐘形成沉淀懸液；輕柔覆蓋細(xì)胞，37°C 孵育 4 - 6 小時(shí)，換液培養(yǎng) 24 - 48 小時(shí)后檢測(cè)基因表達(dá)，轉(zhuǎn)染效率約 30%，成本低廉，但沉淀顆粒不均一、重復(fù)性欠佳，易致細(xì)胞應(yīng)激損傷。
病毒載體轉(zhuǎn)染是基因治療臨床前研究與部分臨床試驗(yàn)階段倚重的高效策略。逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒等經(jīng)基因工程改造，剔除致病基因，保留感染、整合宿主細(xì)胞基因組能力，將外源治療基因精準(zhǔn)輸送、整合入靶細(xì)胞染色體特定區(qū)域。
以慢病毒載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染造血干細(xì)胞為例，科研人員先克隆目標(biāo)基因至慢病毒穿梭質(zhì)粒，與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞，48 - 72 小時(shí)后收集富含重組慢病毒上清液；超速離心濃縮、過(guò)濾除菌；將造血干細(xì)胞與病毒液按感染復(fù)數(shù)（MOI）10 - 50 孵育 6 - 12 小時(shí)，借熒光標(biāo)記基因監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染效率高達(dá) 80% 以上，基因長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)，但病毒載體免疫原性、潛在致瘤風(fēng)險(xiǎn)是臨床轉(zhuǎn)化掣肘難題。
轉(zhuǎn)染效率直觀反映外源基因成功導(dǎo)入細(xì)胞的比例，關(guān)乎實(shí)驗(yàn)成敗。常用檢測(cè)手段涵蓋熒光顯微鏡直接觀測(cè)熒光蛋白表達(dá)、流式細(xì)胞術(shù)精準(zhǔn)定量熒光陽(yáng)性細(xì)胞比率、定量 PCR 測(cè)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)目的基因拷貝數(shù)等。不同檢測(cè)各有優(yōu)劣，熒光顯微鏡簡(jiǎn)便直觀卻易受主觀判斷干擾；流式細(xì)胞術(shù)通量高、精度準(zhǔn)，但儀器昂貴、樣本處理繁瑣；定量 PCR 靈敏度超群，可精準(zhǔn)量化基因拷貝，卻對(duì)樣本純度、操作規(guī)范性要求嚴(yán)苛。
細(xì)胞毒性評(píng)估旨在監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染流程對(duì)細(xì)胞生理機(jī)能損害程度，關(guān)乎細(xì)胞存活、增殖及后續(xù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠性。乳酸脫氫酶（LDH）釋放實(shí)驗(yàn)借檢測(cè)細(xì)胞受損后胞內(nèi) LDH 逸出量評(píng)估膜完整性；MTT、CCK - 8 比色法通過(guò)活細(xì)胞代謝還原試劑顯色深淺量化細(xì)胞活性；顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，如胞體腫脹、膜泡形成、核固縮等異常表征輔助判斷毒性強(qiáng)弱。理想轉(zhuǎn)染應(yīng)在保障高效基因遞送同時(shí)，將細(xì)胞毒性控制在低限度。
基因轉(zhuǎn)染后持續(xù)、穩(wěn)定表達(dá)是眾多長(zhǎng)期研究訴求，尤其在基因治療領(lǐng)域。借助 Western blot 監(jiān)測(cè)目的蛋白表達(dá)量動(dòng)態(tài)變化、熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)實(shí)時(shí)追蹤基因轉(zhuǎn)錄活性，科研人員可洞悉轉(zhuǎn)染基因表達(dá)時(shí)效特征；基因組 DNA 測(cè)序、Southern blot 則用于剖析外源基因整合位點(diǎn)、拷貝數(shù)變異，闡釋表達(dá)穩(wěn)定性分子機(jī)制，為優(yōu)化轉(zhuǎn)染策略夯實(shí)數(shù)據(jù)根基。
納米材料家族如金納米粒子、碳納米管、量子點(diǎn)衍生納米復(fù)合物，為基因轉(zhuǎn)染注入全新活力。這些納米級(jí)載體粒徑精準(zhǔn)可控，表面經(jīng)功能基團(tuán)修飾后親和核酸、靶向細(xì)胞特異性受體，實(shí)現(xiàn)高效、低毒基因轉(zhuǎn)運(yùn)。
研究團(tuán)隊(duì)創(chuàng)新性合成聚乙二醇修飾金納米棒 - 核酸復(fù)合物，金納米棒更好光學(xué)特性利于實(shí)時(shí)示蹤轉(zhuǎn)染路徑；表面 PEG 鏈屏蔽免疫識(shí)別、降低非特異性吸附，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞效率較傳統(tǒng)脂質(zhì)體提升 30%，細(xì)胞毒性削減 50%，彰顯納米材料在腫瘤基因治療精準(zhǔn)遞送層面巨大潛力。
CRISPR - Cas 基因編輯技術(shù)與轉(zhuǎn)染技術(shù)深度融合，革新基因功能研究范式。科研人員借 CRISPR - Cas9 系統(tǒng)搭載 sgRNA 及外源修復(fù)模板轉(zhuǎn)染細(xì)胞，精準(zhǔn)敲除、插入或修復(fù)靶基因，實(shí)現(xiàn)基因原位編輯；基于 Cas13 蛋白靶向 RNA 切割活性，拓展至 RNA 編輯、調(diào)控領(lǐng)域。
在杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（DMD）細(xì)胞模型構(gòu)建中，將編碼 Cas9、sgRNA 及正常 dystrophin 基因 cDNA 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染患者來(lái)源肌細(xì)胞，經(jīng)篩選鑒定，成功修復(fù)致病基因突變、恢復(fù)肌蛋白表達(dá)，為遺傳性疾病基因治療勾勒希望曙光。
外源基因轉(zhuǎn)染技術(shù)雖成果斐然，但前路漫漫。如何跨越不同細(xì)胞類型固有轉(zhuǎn)染壁壘，開(kāi)發(fā)普適、高效轉(zhuǎn)染試劑仍是難題；降低病毒載體免疫副反應(yīng)、提升納米載體生物安全性與代謝穩(wěn)定性，亟待材料學(xué)、醫(yī)學(xué)多學(xué)科協(xié)同破局；轉(zhuǎn)染后基因表達(dá)精準(zhǔn)時(shí)空調(diào)控，契合生理病理進(jìn)程需求，呼喚合成生物學(xué)深度介入。
展望未來(lái)，隨著單細(xì)胞測(cè)序、人工智能輔助藥物設(shè)計(jì)蓬勃興起，外源基因轉(zhuǎn)染技術(shù)有望迎來(lái)個(gè)性化定制時(shí)代。借助大數(shù)據(jù)精準(zhǔn)解析細(xì)胞異質(zhì)性，人工智能模擬優(yōu)化轉(zhuǎn)染方案，靶向遞送基因、智能調(diào)控表達(dá)將不再遙遠(yuǎn)，解鎖更多生命科學(xué)未知疆域，托舉基因治療臨床轉(zhuǎn)化愿景落地。
綜上，外源基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞技術(shù)作為生命科學(xué)研究基石，正歷經(jīng)持續(xù)蛻變，從基礎(chǔ)原理深耕至前沿應(yīng)用拓展，每一次技術(shù)革新都為學(xué)界注入前行動(dòng)力，激勵(lì)科研人員勇攀生命密碼解析高峰，推動(dòng)生物醫(yī)學(xué)闊步邁向精準(zhǔn)、治愈新紀(jì)元。
