一、引言

在現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，基因治療作為一種潛力的治療手段受到了廣泛關(guān)注。基因治療的關(guān)鍵在于高效、安全的基因傳遞載體，能夠?qū)⒅委熜曰驕?zhǔn)確地遞送至靶細(xì)胞并實(shí)現(xiàn)有效的表達(dá)。傳統(tǒng)的病毒載體雖然轉(zhuǎn)染效率較高，但存在免疫原性、潛在致癌性等安全隱患。因此，非病毒載體的研發(fā)成為了當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

納米材料由于其更好的物理化學(xué)性質(zhì)，如小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)等，在基因傳遞領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。其中，硅納米材料因其良好的生物相容性、易于表面修飾等優(yōu)點(diǎn)而備受青睞。多聚賴氨酸（PLL）作為一種陽(yáng)離子聚合物，具有與核酸分子靜電相互作用的能力，可有效壓縮和保護(hù)核酸。將多聚賴氨酸與硅納米材料結(jié)合，有望制備出一種新型的高效、低毒的基因轉(zhuǎn)染載體。本研究旨在制備多聚賴氨酸硅納米（PLL - SiNPs），并對(duì)其轉(zhuǎn)染性能進(jìn)行深入研究。

二、材料與方法

（一）材料

正硅酸乙酯（TEOS）、氨水（NH??H?O）、多聚賴氨酸（PLL，不同分子量）、熒光標(biāo)記的 DNA（F - DNA）、細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、3 - （4,5 - 二甲基噻唑 - 2 - 基） - 2,5 - 二苯基四氮唑溴鹽（MTT）等。實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞系包括 HeLa 細(xì)胞和 293T 細(xì)胞。

（二）多聚賴氨酸硅納米（PLL - SiNPs）的制備

硅納米顆粒（SiNPs）的合成
在乙醇 - 水混合溶液中，以氨水為催化劑，通過(guò)正硅酸乙酯（TEOS）的水解和縮聚反應(yīng)制備硅納米顆粒。具體步驟如下：將一定量的乙醇、水和氨水混合均勻，在劇烈攪拌下緩慢滴加 TEOS。反應(yīng)在室溫下持續(xù)一定時(shí)間后，通過(guò)離心收集生成的 SiNPs，并用乙醇多次洗滌以去除雜質(zhì)，最后將 SiNPs 分散在去離子水中備用。

多聚賴氨酸修飾硅納米顆粒（PLL - SiNPs）的制備
將合成的 SiNPs 分散液與不同濃度的多聚賴氨酸溶液混合，在特定的 pH 和溫度條件下反應(yīng)一定時(shí)間。反應(yīng)過(guò)程中，多聚賴氨酸通過(guò)靜電作用和化學(xué)鍵合（如氨基與硅羥基之間的反應(yīng)）等方式結(jié)合到硅納米顆粒表面。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)離心和透析等方法去除未結(jié)合的多聚賴氨酸，得到 PLL - SiNPs 分散液。

（三）PLL - SiNPs 的表征

粒徑和 zeta 電位測(cè)定
使用動(dòng)態(tài)光散射儀（DLS）測(cè)量 PLL - SiNPs 的粒徑大小和粒徑分布，同時(shí)測(cè)定其 zeta 電位，以評(píng)估其表面電荷性質(zhì)。

形態(tài)觀察
通過(guò)透射電子顯微鏡（TEM）觀察 PLL - SiNPs 的微觀形態(tài)，包括顆粒的形狀、大小和分散情況。

傅里葉變換紅外光譜（FT - IR）分析
采用 FT - IR 光譜儀對(duì) PLL - SiNPs 進(jìn)行分析，通過(guò)對(duì)比 SiNPs 和 PLL - SiNPs 的紅外光譜，確定多聚賴氨酸與硅納米顆粒之間的化學(xué)鍵合情況。

（四）細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞培養(yǎng)
將 HeLa 細(xì)胞和 293T 細(xì)胞分別接種于含有適量胎牛血清和抗生素的 DMEM 培養(yǎng)基中，在 37°C、5% CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至合適密度時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)
將不同濃度的 PLL - SiNPs 與熒光標(biāo)記的 DNA（F - DNA）混合，在特定條件下孵育一定時(shí)間，形成 PLL - SiNPs/F - DNA 復(fù)合物。然后將復(fù)合物加入到培養(yǎng)的細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間。轉(zhuǎn)染結(jié)束后，使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)的熒光信號(hào)，以評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)，設(shè)置不同的對(duì)照組，如僅加 DNA 組、僅加 PLL - SiNPs 組、陽(yáng)性對(duì)照組（使用已知轉(zhuǎn)染試劑）等。

（五）細(xì)胞毒性評(píng)估

采用 MTT 法評(píng)估 PLL - SiNPs 的細(xì)胞毒性。將不同濃度的 PLL - SiNPs 加入到培養(yǎng)的細(xì)胞中，培養(yǎng)一定時(shí)間后，加入 MTT 溶液繼續(xù)培養(yǎng)。然后去除上清液，加入二甲基亞砜（DMSO）溶解結(jié)晶物，使用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值。根據(jù)吸光度值計(jì)算細(xì)胞存活率，以評(píng)估 PLL - SiNPs 對(duì)細(xì)胞的毒性作用。

三、結(jié)果與討論

（一）PLL - SiNPs 的表征結(jié)果

粒徑和 zeta 電位
DLS 測(cè)量結(jié)果顯示，制備的 PLL - SiNPs 粒徑分布較為均勻，平均粒徑在一定范圍內(nèi)（具體數(shù)值根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)）。zeta 電位分析表明，PLL - SiNPs 表面帶有正電荷，這有利于其與帶負(fù)電荷的 DNA 之間的靜電相互作用。隨著多聚賴氨酸修飾量的增加，粒徑略有增大，zeta 電位也相應(yīng)升高，這與多聚賴氨酸的結(jié)合情況相符。

形態(tài)觀察
TEM 圖像顯示，PLL - SiNPs 呈球形，分散良好，無(wú)明顯團(tuán)聚現(xiàn)象。納米顆粒的尺寸與 DLS 測(cè)量結(jié)果基本一致，表面較為光滑，說(shuō)明多聚賴氨酸的修飾并未對(duì)硅納米顆粒的形態(tài)產(chǎn)生顯著影響。

FT - IR 分析
FT - IR 光譜結(jié)果顯示，PLL - SiNPs 在特定波數(shù)處出現(xiàn)了多聚賴氨酸的特征吸收峰，與純多聚賴氨酸和 SiNPs 的光譜相比，證實(shí)了多聚賴氨酸成功修飾到硅納米顆粒表面。同時(shí)，一些化學(xué)鍵的變化也表明了兩者之間存在化學(xué)鍵合作用，這為 PLL - SiNPs 的穩(wěn)定性提供了保障。

（二）轉(zhuǎn)染效率評(píng)估

熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明，PLL - SiNPs/F - DNA 復(fù)合物能夠有效地將熒光標(biāo)記的 DNA 遞送至細(xì)胞內(nèi)。在一定濃度范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)染效率隨著 PLL - SiNPs 濃度的增加而升高。與對(duì)照組相比，PLL - SiNPs 表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)染效率，尤其在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，其轉(zhuǎn)染效率接近甚至在某些細(xì)胞系中超過(guò)了陽(yáng)性對(duì)照組的轉(zhuǎn)染試劑。不同細(xì)胞系對(duì) PLL - SiNPs 的轉(zhuǎn)染效率有所差異，這可能與細(xì)胞的類型、膜表面性質(zhì)等因素有關(guān)。

（三）細(xì)胞毒性分析

MTT 法測(cè)定的細(xì)胞存活率結(jié)果顯示，在較低濃度下，PLL - SiNPs 對(duì) HeLa 細(xì)胞和 293T 細(xì)胞的毒性較低，細(xì)胞存活率較高。隨著 PLL - SiNPs 濃度的增加，細(xì)胞存活率逐漸降低，但在一定濃度范圍內(nèi)仍保持在可接受的水平。與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染試劑相比，PLL - SiNPs 在相同轉(zhuǎn)染效率下表現(xiàn)出更低的細(xì)胞毒性，這表明其在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的安全性優(yōu)勢(shì)。

四、結(jié)論

本研究成功制備了多聚賴氨酸硅納米（PLL - SiNPs），并對(duì)其物理化學(xué)性質(zhì)、轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性進(jìn)行了全面研究。結(jié)果表明，所制備的 PLL - SiNPs 具有合適的粒徑、正表面電荷和良好的穩(wěn)定性。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，PLL - SiNPs 表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)染效率和較低的細(xì)胞毒性，在基因治療和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，進(jìn)一步的研究仍需優(yōu)化其制備工藝，提高轉(zhuǎn)染效率，降低細(xì)胞毒性，并深入探究其在體內(nèi)的生物分布、代謝等情況，為其臨床應(yīng)用奠定更堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。同時(shí)，本研究為新型基因轉(zhuǎn)染載體的研發(fā)提供了新的思路和方法，有望推動(dòng)基因治療技術(shù)的發(fā)展。

在未來(lái)的研究中，可以考慮對(duì)多聚賴氨酸的分子量、硅納米顆粒的尺寸等參數(shù)進(jìn)行更精細(xì)的調(diào)控，以進(jìn)一步優(yōu)化 PLL - SiNPs 的性能。此外，還可以探索與其他功能分子或材料的聯(lián)合應(yīng)用，賦予 PLL - SiNPs 更多的功能，如靶向性、可降解性等，從而更好地滿足基因治療的復(fù)雜需求。