威尼德紫外交聯(lián)儀：UVB 誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞中 beta- catenin 基因的變化研究

威尼德生物科技（北京）有限公司，使用UVA(365nm)、UVB(302 nm)、UVC(254 nm)三種波長(zhǎng)制造了四款紫外交聯(lián)儀，主要包括VL-1000A系列紫外交聯(lián)儀（365nm）、VL-1000B系列紫外交聯(lián)儀（302nm）、VL-1000C系列紫外交聯(lián)儀（254nm）、VL-3000系列紫外交聯(lián)儀（三種波長(zhǎng)）滿(mǎn)足不同的科研需求。

胡孝輝，高豐厚，方 勇

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第三人民醫(yī)院燒傷整形科 上海 201900）

[ 摘要] 目的：觀(guān)察中波紫外線(xiàn)(UVB)誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞中 β-catenin 及其下游基因 c-myc 的變化，探討其在紫外線(xiàn)誘導(dǎo)光老化和腫瘤發(fā)生中的作用。方法：使用組織塊法分離培養(yǎng)原代成纖維細(xì)胞，使用第 2～8 代人皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行紫外線(xiàn)處理，倒置熒光顯微鏡觀(guān)察其形態(tài)學(xué)改變，β-gal 半乳糖苷酶細(xì)胞衰老試劑盒染色衰老細(xì)胞、western blot 檢測(cè)衰老相關(guān)蛋白 P16的表達(dá)，western blot 檢測(cè)紫外線(xiàn)處理人皮膚成纖維細(xì)胞各時(shí)相點(diǎn) β-catenin、c-myc 蛋白表達(dá)水平，RT-PCR 檢測(cè)紫外線(xiàn)處理人皮膚成纖維細(xì)胞各時(shí)像點(diǎn) β-catenin、c-myc mRNA 水平的表達(dá)變化。結(jié)果：40 mJ/cm2UVB 單次照射后可以誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞衰老，β-gal 衰老染色陽(yáng)性率達(dá)到約 90%，衰老相關(guān)基因 P16 蛋白表達(dá)明顯升高，β-catenin、c-myc 蛋白表達(dá)水平和mRNA 水平照射后較未照射組均明顯降低。結(jié)論：紫外線(xiàn) UVB 處理人皮膚成纖維細(xì)胞可以誘導(dǎo)其發(fā)生衰老改變，衰老細(xì)胞中β-catenin、c-myc 表達(dá)水平明顯降低，這些結(jié)果與皮膚黑色素細(xì)胞瘤相關(guān)基因改變的研究相近，為以后皮膚惡性腫瘤的研究提供了線(xiàn)索。

[ 關(guān)鍵詞] 人皮膚成纖維細(xì)胞；光老化；beta-catenin；c-myc

紫外線(xiàn)照射以后可以誘導(dǎo)皮膚光老化，導(dǎo)致皮膚變得粗糙、皺紋加深[1]，同時(shí)老化可以限制細(xì)胞的無(wú)限制生長(zhǎng)抑制腫瘤的發(fā)生，臨床上發(fā)現(xiàn)皮膚黑色素細(xì)胞瘤多發(fā)生于非日光暴

露部位，是否紫外線(xiàn)在其中起了重要的作用，這其中的機(jī)制還不是十分清楚[2]。有學(xué)者認(rèn)為[3]，光老化是一種癌前狀態(tài)，也有學(xué)者[4]認(rèn)為細(xì)胞衰老是限制細(xì)胞發(fā)生癌變的一種保護(hù)措施。我們的研究通過(guò)紫外線(xiàn)照射正常人皮膚成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)其光老化，并對(duì)成纖維細(xì)胞光老化過(guò)程中 beta-catenin 和c-myc 兩個(gè)癌基因的變化進(jìn)行了初步研究。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器：胎牛血清和高糖 DMED 培養(yǎng)基（Gbico公司），0.25%胰酶－0.02%EDTA,β－gal 半乳糖苷酶細(xì)胞衰老染色試劑盒（碧云天公司），2×SDS 蛋白裂解液（碧云天公

司），兔抗人 β－catenin 抗體，兔抗人 P16 抗體、兔抗人 c－myc 抗體（cell signaling），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔 Ig二抗（cell signaling）。Takara RT-PCR 擴(kuò)增試劑盒（大連

生工）。VL-3000紫外交聯(lián)儀、威尼德生物科技（北京）有限公司，使用UVA(365nm)、UVB(302 nm)、UVC(254 nm)三種波長(zhǎng)制造了四款紫外交聯(lián)儀，主要包括VL-1000A系列紫外交聯(lián)儀（365nm）、VL-1000B系列紫外交聯(lián)儀（302nm）、VL-1000C系列紫外交聯(lián)儀（254nm）、VL-3000系列紫外交聯(lián)儀（三種波長(zhǎng)）滿(mǎn)足不同的科研需求。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人成纖維細(xì)胞的分離與培養(yǎng)：我院泌尿外科兒童包皮環(huán)切術(shù)后包皮（患者知情同意），去除皮下脂肪及血管根據(jù)文獻(xiàn)方法[5]，采用組織塊法分離獲得包皮成纖維細(xì)胞，高糖 DMEM 培養(yǎng)基加 10%胎牛血清培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)至 90%融合后 0.25%胰酶－

0.02%EDTA 消化傳代擴(kuò)增。取第 2～8 代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1.2.2 人成纖維細(xì)胞紫外線(xiàn)誘導(dǎo)光老化：取 2～8 代人成纖維細(xì)胞使用紫外交聯(lián)儀在 312nm 中波紫外線(xiàn)（UVB）下照設(shè),UVB

能量在 20～40mJ/cm2范圍內(nèi)照設(shè)后 48h 按 700 個(gè)細(xì)胞 /cm2 重新接種于六孔板中，24h 候后 β-gal 半乳糖苷酶細(xì)胞衰老染色試劑盒檢測(cè)細(xì)胞衰老情況。1.2.3 蛋白印跡檢測(cè)衰老人成纖維細(xì)胞中 P16、β-catenin、c-myc 蛋白表達(dá)變化：取 2～8 代人成纖維細(xì)胞按 1×106個(gè)每皿接種于直徑 100mm 培養(yǎng)皿中，接種后 24h 細(xì)胞長(zhǎng)至 80%融合，在 40 mJ/cm2UVB 紫外線(xiàn)下照射，于照射后第 0、12、24、48、72h 收集細(xì)胞，2×SDS 蛋白裂解液裂解細(xì)胞收集蛋白，SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，一抗（β-catenin 1:1000，c-myc1:200，P16 1:1000）4℃ 結(jié) 合 過(guò) 夜 ，TBS 洗 滌 3 遍 ， 每 遍10min，加入二抗（1:2000），室溫孵育 2h，ECL 試劑盒顯色，圖像分析儀掃描成像，以 GAPDH 為內(nèi)參進(jìn)行半定量分析。1.2.4 RT-PCR 檢測(cè)衰老人成纖維細(xì)胞中 β-catenin、c-mycm RNA 表達(dá)變化：取 2～8 代人成纖維細(xì)胞按 1×106個(gè)每皿接種于直徑 100mm 培養(yǎng)皿中，接種后 24h 細(xì)胞長(zhǎng)至 80%融合，在40mJ/cm2UVB 紫外線(xiàn)下照射，于照射后第 0、12、24、48、72h 采用 Trizol 法提取細(xì)胞總 RNA 根據(jù) Genbank 中 β-catenin、c-myc 和 GAPDH 的 cDNA 序列設(shè)計(jì)如下引物（上海生工公司合成）。Β-catenin （120bp） 引物：5'-TGG ACT CTG GAA TCCATT CTG－3' （F）, 5'-AAA ATC CCT GTT CCC ACT CA-3'（R）, c-myc (313bp) 引物：5'-TGG ACT CTG GAA TCC ATTCTG-3' （F）, 5'-AAA ATC CCT GTT CCC ACT CA-3'（R），GAPDH（289bp）引物：5'-TGG ACT CTG GAA TCC ATT CTG-3'F）, 5'-AAA ATC CCT GTT CCC ACT CA-3'（R）。以 GAPDH 為內(nèi)參，圖像分析儀掃描成像，ImageQuant 軟件半定量分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 人皮膚成纖維細(xì)胞的分離與培養(yǎng)：采用組織塊法培養(yǎng)第 4 天開(kāi)始有細(xì)胞從組織塊邊緣爬出,第 10～14 天細(xì)胞長(zhǎng)至融合，長(zhǎng)梭形細(xì)胞中間可見(jiàn)鋪路石樣細(xì)胞表皮細(xì)胞，將融合細(xì)胞按 1:3 進(jìn)行傳代，傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)加速第 2 天可融合，從第 2 代開(kāi)始細(xì)胞呈典型的長(zhǎng)梭形，鋪路石樣表皮細(xì)胞消失。2.2 UVB 誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞衰老及 β-gal 半乳糖苷酶細(xì)胞衰

老染色：UVB20～40mJ/cm2能量照射后可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯呈典型衰老形態(tài)，細(xì)胞形態(tài)上變得寬大扁平，胞漿透明，胞核內(nèi)顆粒增多，(圖 1①～②)。β-gal 半乳糖苷酶細(xì)胞衰老染色

可見(jiàn)典型衰老細(xì)胞核周染成藍(lán)色, 對(duì)照組細(xì)胞陽(yáng)性率為（18.23±3.24）%，誘導(dǎo)衰老組陽(yáng)性率為（88.75±5.32）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖 1③。2.3 誘導(dǎo)衰老細(xì)胞中 P16 蛋白的表達(dá)：UVB 誘導(dǎo)衰老后第12h 開(kāi)始衰老相關(guān)基因 P16 表達(dá)增加，隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)量也增加，至照射后 24h 開(kāi)始 P16 表達(dá)明顯高于照組前細(xì)胞（見(jiàn)圖 2）。2.4 UVB 誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞衰老后 β-catenin、c-myc蛋白水平變化：UVB40mJ/cm2 照射人皮膚成纖維細(xì)胞后從第12h 開(kāi)始 β-catenin、c-myc 蛋白表達(dá)水平分別開(kāi)始降低，至照射后第 72h 這兩種蛋白的表達(dá)水平降至zui低（見(jiàn)圖 3）。2.5 UVB 誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞衰老后 β-catenin、c-mycmRNA 水 平 變 化 ：UVB40mJ/cm2 照 射 人 皮 膚 成 纖 維 細(xì) 胞 后β-catenin、c-myc mRNA 表達(dá)水平分別從照射后第 48、24h開(kāi)始降低，至照射后第 72h 降至zui低（見(jiàn)圖 4）。威尼德生物科技（北京）有限公司，使用UVA(365nm)、UVB(302 nm)、UVC(254 nm)三種波長(zhǎng)制造了四款紫外交聯(lián)儀，主要包括VL-1000A系列紫外交聯(lián)儀（365nm）、VL-1000B系列紫外交聯(lián)儀（302nm）、VL-1000C系列紫外交聯(lián)儀（254nm）、VL-3000系列紫外交聯(lián)儀（三種波長(zhǎng)）滿(mǎn)足不同的科研需求。

3 討論

β-catenin 基因位于 3p21, 全長(zhǎng) 40 992 bp, 人類(lèi)的β-catenin 基因產(chǎn)物是一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為 88 000 的蛋白質(zhì)，呈高度進(jìn)化保守性，大約保留了果蠅 80%的同源蛋白，與鼠的 β-catenin 幾乎*同源[6]。β-catenin 是 Wnt 通路的核心信號(hào)分子，以往研究表明[7]β-catenin 基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵的作用。最近研究報(bào)道[8]在人皮膚黑色素細(xì)胞瘤中 β-catenin 高表達(dá)并可以抑制衰老相關(guān)基因P16 的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞不發(fā)生衰老保持永生化狀態(tài)，β-catenin 上調(diào)其下游基因 c-myc、cyclinD1 的表達(dá)啟動(dòng)腫中國(guó)美容醫(yī)學(xué)中國(guó)美容醫(yī)學(xué)2010 年 5 月第 19 卷第 5 期 Chinese Journal of Aesthetic Medicine.May.2010.Vol.19.No.5基礎(chǔ)研究瘤的發(fā)生。而在 β-catenin 基因敲除小鼠黑色素細(xì)胞瘤中P16 表達(dá)呈劑量依賴(lài)性增加[9]。在臨床上黑色素細(xì)胞瘤多發(fā)生于紫外線(xiàn)所照不到的地方，且在紫外線(xiàn)照不到的部位β-catenin 基因高表達(dá)，這說(shuō)明 β-catenin 基因的表達(dá)和

降解與紫外線(xiàn)照射之間存在著一定的關(guān)系。研究報(bào)道[10]Braf 誘導(dǎo)的衰老在哺乳動(dòng)物中是限制癌前病變的生理機(jī)制, 由于紫外線(xiàn)照射以后 Braf 基因的突變刺激 P16 的過(guò)度表達(dá)，細(xì)胞隨后進(jìn)入衰老狀態(tài)，而在日光保護(hù)部位 Braf 基因突變減少，P16 的過(guò)度表達(dá)也不能被很好的誘導(dǎo)[11]。在非日光暴露部位 β-catenin 基因抑制 P16 的表達(dá),使衰老延遲,但同時(shí)也增加了其發(fā)生腫瘤的機(jī)會(huì).而日光暴露部位因?yàn)?nbsp;βcatenin 基因表達(dá)減少, 導(dǎo)致 P16 高表達(dá),使

衰老提前發(fā)生。我們的研究證實(shí)通過(guò)紫外線(xiàn)照射以后成纖維細(xì)胞形態(tài)變的寬大扁平，胞漿透明，胞核顆粒增多，呈現(xiàn)典型的 衰老 表 現(xiàn) ， 衰 老 相 關(guān) 基 因 P16 蛋 白 表 達(dá) 也 增 高 ，而β-catenin 基因和其下游基因 c－myc 在蛋白水平和 m RNA水平表達(dá)均明顯降低，且隨著衰老時(shí)間的延長(zhǎng)其表達(dá)水平降低越明顯，這樣就顯著降低了其發(fā)生腫瘤的可能性。

在我們的研究中對(duì)紫外線(xiàn)誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞衰老的機(jī)制進(jìn)行的初步研究，并發(fā)現(xiàn) β-catenin、c－myc 基因在紫外線(xiàn)照射以后呈時(shí)間依賴(lài)性減少，為以后光療治療腫瘤提供了依據(jù)。但對(duì)紫外線(xiàn)照射通過(guò)何種途徑誘導(dǎo) β-catenin及其下游基因 c－myc 減少則沒(méi)有進(jìn)行進(jìn)一步的研究；而且臨床上體表皮膚腫瘤多發(fā)生于老年人這和我們的研究結(jié)果存在矛盾，這其中的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。