常見問題

Q1：標(biāo)記方法有哪幾種？

A1：（1）切口平移法（2）隨機引物法（3）末端標(biāo)記法（4）單鏈DNA探針標(biāo)記（5）寡核苷酸探針標(biāo)記法
Q2：探針標(biāo)記物的分類有幾種？

A2：（1）探針標(biāo)記物有放射性核素與非放射性物質(zhì)兩種。放射性核素標(biāo)記敏感性高，可檢測pg水平的核酸，但因不易長期保存，且存在放射性污染等問題，現(xiàn)已較少應(yīng)用。

（2）非放射性物質(zhì)常用的有生物素、地高X等，非放射性探針安全、穩(wěn)定、操作方便并且經(jīng)濟，但敏感性較低，近年來，由于雜交信號檢測方法的改進，檢測的敏感性得到了很大提高。

Q3：怎樣確定探針的濃度？

A3：總的來說，隨探針濃度增加，雜交率也增加。另外，在較窄的范圍內(nèi)，隨探針濃度增加，敏感性增加。要獲得較滿意的敏感性，膜核酸分子雜交中放射性核素標(biāo)記探針與非放射性標(biāo)記探針的用量分別為5-10 ng/ml和25-1000 ng/ml，而原位雜交中，無論應(yīng)用何種標(biāo)記探針，其用量均為0.5-5.0 μg/ml。

Q4：如何選擇核酸分子雜交的最適溫度？

A4：核酸分子雜交技術(shù)最重要的因素之一是選擇最適的核酸分子雜交反應(yīng)溫度。若反應(yīng)溫度低于Tm 10-15 ℃，堿基順序高度同源的互補鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈，錯配對減少。若反應(yīng)溫度再低（Tm-30 ℃），雖然互補鏈之間也可形成穩(wěn)定的雙鏈，但互補堿基配對減少，錯配對增多、氫鍵結(jié)合的更弱。如兩個同源性在50%左右或更低些的DNA，調(diào)整雜交溫度可使它們之間的雜交率變化10倍，因此在實驗前必須首先確定雜交溫度。通常有三種溫度可供試驗，即最適復(fù)性溫度、苛刻復(fù)性溫度及非苛刻復(fù)性溫度。最適復(fù)性溫度：Tor =Tm–25 ℃苛刻復(fù)性溫度：Ts = Tm – (10或15 ℃)非苛刻復(fù)性溫度：Tns =Tm – (30或35 ℃)

 Q5：核酸雜交篩選寡核苷酸探針遵循哪些原則？

 A5：（1）長18-50 nt，較長探針雜交時間較長，合成量低；較短探針特異性會差些。

　   （2）堿基成分：G+C含量為40%-60%，超出此范圍則會增加非特異核酸雜交。

　  （3）探針分子內(nèi)不應(yīng)存在互補區(qū)，否則會出現(xiàn)抑制探針雜交的“發(fā)夾"狀結(jié)構(gòu)。

　 （4）避免單一堿基的重復(fù)出現(xiàn)（不能多于4個），如-CCCCC-。

（5）一旦選定某一序列符合上述標(biāo)準，最好將序列與核酸庫中核酸序列比較，探針序列應(yīng)與含靶序列的核酸雜交，而與非靶區(qū)域的同源性不能超過70%或有連續(xù)8個或更多的堿基的同源，否則，該探針不能用。

Q6：合成的寡核苷酸探針具有哪些優(yōu)點？

A6：（1）由于鏈短，其序列復(fù)雜度低，分子量小，所以和等量靶位點*雜交的時間比克隆探針短，如20 nt的寡核苷酸探針在濃度為100 ng/ml，靶序列為1-100 pg、1 kb片段時，達到核酸分子雜交只需10 min，而用2 kb的克隆探針在同樣條件下達到*核酸分子雜交則需16 h。

（2）寡核苷酸探針可識別靶序列內(nèi)1個堿基的變化，因為短探針中堿基的錯配能大幅度地降低雜交體的Tm值。

（3）一次可大量合成寡核苷酸探針（1-10 mg），使得這種探針價格低廉，與克隆探針一樣，寡核苷酸探針能夠用酶學(xué)或化學(xué)方法修飾以進行非放射性標(biāo)記物的標(biāo)記。盡管克隆探針較特異，但通過細心篩選序列或選擇相對長的序列（＞30 nt）也可設(shè)計出非常特異的寡核苷酸探針。常用的寡核苷酸探針有18-40個堿基，目前的合成儀可有效地合成至少50個堿基的探針。